转移因子对猪丹毒杆菌SpaA抗原免疫效果的影响

为了探寻转移因子(Transfer factor,TF)对猪丹毒杆菌SpaA(Surface protective antigen A)蛋白抗原免疫效果的影响,将重组SpaA蛋白与双相佐剂乳化后(称SpaA抗原)免疫小鼠,取免疫小鼠和未免疫小鼠脾脏,以超滤法分别制备特异性TF和普通TF,并利用BCA法测定所得TF的质量分数,经过无菌及安全性检测后,将2种TF分别腹腔接种至小鼠体内,24 h后,对2组TF处理后的小鼠均免疫SpaA抗原,并以未接种TF的免疫小鼠作为对照(仅免疫组)。分别于免疫后12 d、21 d和30 d对小鼠进行采血,用间接ELISA法对小鼠血清进行抗体检测。结果表明,利用原核表达系统表达的重组SpaA蛋白分子质量60 ku且具有可溶性;以超滤法制备的特异性TF质量浓度为2.56 mg/mL,普通TF质量浓度为2.40 mg/mL,且2种TF安全无毒;抗体检测数据显示,2种TF处理组在免疫后21、30 d的抗体水平均高于仅免疫组,且差异显著,而2种TF处理组之间抗体水平差异不显著。因此,TF能诱导SpaA抗原快速产生抗体,提高SpaA抗原的免疫效果,但与TF的特异性关系不大,表明TF可作为猪丹毒杆菌基因工程亚单位疫苗的免疫增效剂,提高免疫动物的抗体水平。     

PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的研究

【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV VP2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和VP2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2,表达出可溶性蛋白Cap和VP2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV VP2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV VP2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、VP2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。     

猪圆环病毒2型感染对猪瘟疫苗免疫效果的影响

为探索在猪圆环病毒2型(PCV-2)阳性猪场免疫猪圆环病毒疫苗对猪场实际临床生产中猪瘟疫苗免疫效果的影响,遂将某规模化猪场的一栋存在PCV-2感染的150头产房仔猪随机分为试验组和对照组,每组75头,试验组在14日龄免疫某进口PCV-2杆状病毒载体灭活疫苗,对照组不免疫,并分别在PCV-2疫苗免疫前和猪瘟疫苗二免后30天每组随机采血18头仔猪检测猪瘟抗体。结果显示:PCV-2疫苗免疫前两组仔猪的猪瘟抗体水平无明显差异,猪瘟疫苗二免后30天,试验组的猪瘟抗体平均值和猪瘟抗体离散度均显著好于对照组。表明,PCV-2的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫应答,在PCV-2阳性猪场免疫猪圆环病毒疫苗能够显著增强猪瘟疫苗的免疫效果。     

高效佐剂对猪细小病毒和圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果

为评价高效佐剂VA5对猪细小病毒和猪圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果,将VA5与猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗混合免疫BALB/c小鼠和豚鼠。结果显示,VA5佐剂能明显提高猪细小病毒血凝抑制抗体效价和血清病毒中和抗体效价,亦能提高猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体效价,并可降低二种抗原的使用量。VA5佐剂显著提高小鼠和豚鼠免疫后的淋巴细胞刺激指数。攻毒后,VA5佐剂处理组动物脾脏PCV2/PPV病毒载量明显低于不含高效佐剂的免疫组。VA5佐剂能提高猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗在小鼠/豚鼠中的抗体效价,提高细胞免疫力,降低攻毒后的排毒。     

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。     

猪脾转移因子对肉鸡免疫效果的影响研究

为研究猪脾转移因子（TF）对肉鸡疫苗的免疫增强作用，在肉鸡免疫过程的不同时间加入不同剂量转移因子作对比试验，并在对照组A、试验组B1、试验组B2三组鸡群做ND抗体检测、IB抗体检测、IBD抗体检测，脾脏、法氏囊重量测定和出栏效果检测。结果表明，添加不同剂量TF的试验组B1和B2在ND抗体检测、IB抗体检测、IBD抗体检测，脾脏、法氏囊重量测定和出栏效果等方面显著高于对照组A，差异显著（P<0.05），试验组B1和试验组B2之间差异不显著（P>0.05）；由此可知，TF可作为禽疫苗免疫增强剂，促进免疫器官的生长，提高免疫水平，增强机体抗病能力。     

PCV2 Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及蛋白免疫印迹试验验证,重组蛋白主要以可溶性形式表达,少数为包涵体蛋白。以Ni-NTA树脂进行蛋白纯化,纯化后蛋白浓度为629μg·mL^-1,采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩,浓缩后蛋白终浓度为1.8 mg·mL^-1。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后制备抗原,免疫兔子采集全血,分离血清。经蛋白免疫印迹试验,该多抗与重组蛋白存在免疫反应性,ELISA检测抗体效价可达1∶32 000,IFA试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒2型。Cap蛋白多克隆抗体的成功制备,为后续猪圆环病毒2型基因工程疫苗制备过程中验证Cap体外蛋白表达提供了材料。     

猪脾转移因子的制备与生物学特性研究

试验采用透析法提取了猪脾转移因子(TF),并对其理化特性、生物安全性以及其对非特异性和特异性免疫的影响等方面进行了初步研究。结果表明,利用透析法制备的猪脾TF能够显著(P<0.05)增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力;对于E玫瑰花环的形成数和形成率具有极显著(P<0.01)的促进作用;将猪脾TF与猪瘟疫苗同时使用,能够显著(P<0.05)提高机体体液免疫的抗体滴度。此外,制备的猪脾TF安全无毒、无抗原性,不会使异种动物体内产生相应抗体。表明猪脾TF对于机体的特异性和非特异性免疫均有促进作用,是一种安全的生物免疫调节剂。     

猪脾脏转移因子的制备及其活性的检测

采用冻融–透析法提取了猪脾脏转移因子(TF),并对其生物活性进行了检测。结果表明,TF可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,增加E玫瑰花环的形成率,表明TF具有免疫增强作用,可为生产和临床应用提供依据。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

猪圆环病毒疫苗对仔猪生产性能的效果评估

为评估圆环疫苗免疫对猪生长性能的影响,选取2 598头14日龄仔猪分为3组,分别免疫1头份猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)疫苗、0.5头份PCV2疫苗和生理盐水,通过对比仔猪生长性能指标对疫苗免疫效果进行评价。结果表明,疫苗剂量对断奶仔猪平均日增重和死亡率的影响差异不显著(P>0.05),70日龄时1头份疫苗免疫组平均日增重显著高于生理盐水处理组。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒VP2融合IFN-γ提高其在小鼠体内免疫原性

为了检验细胞因子IFN-γ与猪细小病毒VP2融合蛋白的免疫效力,通过重叠延伸PCR技术将IFN-γ与PPV的VP2基因融合到一起,利用杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒r Bac-VP2、r Bac-VP2-IFN-γ,并在小鼠上验证了免疫原性。猪细小病毒ELISA抗体和中和抗体检测结果显示,VP2-IFN-γ组明显高于VP2和PPV灭活苗组;淋巴细胞增殖试验结果表明,VP2-IFN-γ组淋巴细胞数明显高于不加IFN-γ组。上述结果表明IFN-γ可提高猪细小病毒亚单位疫苗体液和细胞免疫应答,为重组IFN-γ的猪细小病毒病亚单位疫苗开发提供理论依据。     

猪圆环病毒2型感染后猪血液学指标研究

为观察PCV2感染猪对其血常规及生化指标变化的影响,将6头PCV2抗体阴性的21日龄断奶仔猪随机分成攻毒组和对照组,攻毒组经颈部肌肉及口鼻分别接种PCV2-BH毒株,攻毒后检测部分血常规指标、免疫球蛋白质量浓度及部分血清生化指标。结果显示,感染后第4天和第7天,白细胞总数分别是正常生理水平的74.2%、79.9%;感染后第7天,淋巴细胞百分比是正常生理水平的35.05%,差异达显著水平(P<0.05),单核细胞和中性粒细胞百分比均显著低于对照组,说明PCV2感染降低了机体的先天免疫机能,增加了继发感染的几率,同时还说明PCV2-BH株具有较好的抗原性;攻毒组血清全部转阳,说明PCV2-BH毒株具有较好的免疫原性,可作为开发PCV2疫苗的候选毒株。     

广西首例猪圆环病毒3型的发现及其衣壳蛋白序列分析

[目的]明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据.[方法]采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位.[结果]在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3.PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017.PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性.[结论]广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行.     

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL^-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV 亚单位疫苗提供了参考。     

猪IL-2与IL-6的原核表达及其对伪狂犬病基因缺失疫苗的佐剂效应研究

 将猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)的cDNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a及pGEX-KG上,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导产生重组蛋白pIL-2与pIL-6,表达量分别占菌株总蛋白的43.45％和28.37％,经提纯后含量可分别达到97.06％和86.37％。将提纯后不同剂量的两种重组蛋白以单独或组合的方式,加入伪狂犬病(Ea株)TK~-/gG~-双基因缺失疫苗中,使每头份疫苗分别含2、5和10μg·ml~(-1)的pIL-2或(和)pIL-6,用此疫苗免疫伪狂犬病抗体阴性猪。同时设试验对照组。初次免疫30d后加强免疫,测定中和抗体,观察试验猪的日增重情况,进行统计分析。发现各试验组的抗体水平均高于不含重组蛋白的基因缺失疫苗组;其中,含2μg·ml~(-1)pIL-2试验组与含10μg·ml~(-1)pIL-2/pIL-6试验组抗体水平和基因缺失疫苗对照组之间呈显著差异(P=0.019)与极显著差异(P=0.009)。结果表明,大肠杆菌表达的pIL-2、pIL-6对伪狂犬病鄂A株基因缺失疫苗(TK~-/gG~-/LacZ~+)有较强的佐剂效应,且呈剂量相关性。不同试验组日增重比较结果表明,免疫效果高低与猪的生长速度呈正相关。本试验为重组pIL-2与pIL-6作为新型疫苗佐剂应用提供了重要的试验依据。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

试验以猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的ORF5和猪圆环病毒2（PCV-2）的ORF2为目的基因,以pIRES-neo为表达载体,构建了PRRSV—PCV-2二联核酸疫苗,并对其免疫原性进行了初步的研究,为研制安全有效的疫苗防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供基础。