芥菜型油菜黄化突变体L638-y叶片氨基酸合成代谢的变化

【目的】探明芥菜型油菜黄化突变体L638-y叶片氨基酸合成代谢网络变化。【方法】以芥菜型油菜黄化突变体L638-y及其野生型L638-g为材料,用氨基酸自动分析仪及实时定量PCR,检测并分析了幼苗叶片游离氨基酸含量及氨基酸合成代谢中8个重要基因的相对表达量。【结果】1) 芥菜型油菜黄化突变体L638-y幼苗叶片游离氨基酸总量低于野生型L638-g,被检测出的17种游离氨基酸中,有10种氨基酸含量低于野生型L638-g,而其他7种则高于野生型L638-g;各游离氨基酸的含量在突变体L638-y与野生型L638-y叶片之间变化幅度不尽相同,其中差异显著的是甘氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸,谷氨酸的变化最小。2) 氨基酸合成代谢中8个重要基因表达量变化的分析结果表明,仅谷氨酸族氨基酸生物合成的谷氨酸合酶基因（GSR）的表达在L638-y中呈上调表达趋势,其余的7个基因,即谷氨酰胺合成酶基因(GLN)、天冬氨酸氨基转移酶基因(GOT)、天冬酰胺合成酶基因(ASN)、Δ′-二氢吡咯-5-羧酸还原酶基因(P5CR)、丙氨酸氨基转移酶基因(AAT)、3-磷酸甘油酸脱氢酶基因(PGDH)、ATP磷酸核糖转移酶基因（ATP-PRT）均下调表达。3) 在突变体L638-y叶片氨基酸合成代谢途径中,8个重要基因表达量的变化与相关游离氨基酸含量的变化并不一致,表明氨基酸合成代谢受到了抑制。【结论】芥菜型油菜黄化突变体L638-y幼苗叶片中氨基酸合成代谢和氮代谢受到了抑制。     

芥菜型油菜黄化突变体L638-y的遗传及黄化基因gr1的分子标记

【目的】研究芥菜型油菜黄化突变体L638-y黄化性状的遗传规律,并初步定位黄化基因gr1。【方法】以芥菜型油菜黄化突变体L638-y分别与正常绿色的渭源大黄芥、2598进行杂交,根据杂交F1、F2和BC1材料单株的叶色调查结果进行遗传分析;以从L638-y与2598杂交后代选育得到的近等基因系(Near-isogenic line,NIL)为材料,选用SRAP、SSR、RAPD和AFLP分子标记,采用BSA(Bulk segregant analysis)法,初步定位黄化基因gr1。【结果】芥菜型油菜黄化突变体L638-y的黄化性状受2对隐性核基因控制,将其分别命名为gr1、gr2。将黄化基因gr1初步定位在2个AFLP分子标记EA4TG4和EA7MC1之间,其与2个标记间的遗传距离分别为33.6与21.5cM。【结论】芥菜型油菜黄化突变体L638-y的黄化性状受2对隐性核基因控制,且黄化基因gr1初步定位在EA4TG4和EA7MC1之间。     

过表达玉米ZmSC1基因增强转基因拟南芥的耐盐性

旨在从玉米中克隆耐盐相关基因ZmSC1,分析其分子特征并在拟南芥中研究其耐盐性的生物学功能。以玉米B73为试验材料,克隆ZmSC1全长序列,与其他物种进行同源性比对,解析其盐诱导表达模式和亚细胞定位情况,将ZmSC1转入到拟南芥突变体atsc和野生型中,观察在盐处理下种子萌发率和主根根长情况,利用荧光定量PCR分析相关逆境（140 mmol·L^-1胁迫）基因的表达量。结果表明,ZmSC1基因全长为423 bp,编码141个氨基酸,ZmSC1和小麦、拟南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有较高保守性。烟草细胞瞬时表达、玉米原生质体亚细胞定位研究表明ZmSC1定位于细胞膜中。生物学功能研究发现在140 mmol·L^-1的NaCl的盐处理下,相比较于拟南芥突变体,回补植株拟南芥的种子萌发率和主根根长得到了明显改善,这说明ZmSC1基因可以回补拟南芥同源基因AtSC1突变体植株在盐胁迫下的表型。ZmSC1基因过表达拟南芥植株的种子萌发率和主根根长也显著高于野生型植株。荧光定量PCR结果显示相较于野生型,在过表达植株中AtRD29A、AtSOS2、AtSOS3、AtCDPK1等胁迫相关基因的表达量也明显增强。研究结果表明TaSC1、AtSC1的同源基因ZmSC1对提高拟南芥的耐盐性具有重要作用。     

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

CAPS标记在番茄抗黄化曲叶病毒病基因 Ty1和Ty3遗传关系分析上的应用

以分别携带有 Ty1/ Ty1· Ty3a/ Ty3a和 Ty1/ Ty1· Ty3/ Ty3的番茄材料09（1）和09（2）为亲本的F₂群体的89个单株为研究对象,利用分子标记的方法对F₂群体所有单株的抗病基因型进行检测。结果发现,明显发生交换的单株有6个,占到F₂群体89个单株的6.74%。表明 Ty1位点与 Ty3位点之间属于不完全连锁关系且连锁较紧密,为番茄抗病基因 Ty1和 Ty3（或 Ty3a）的聚合育种提供一定的理论依据。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。     

芥菜型油菜类黄酮合成相关基因的克隆和序列分析

 【目的】分离和克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因。【方法】采用同源克隆基因的方法，参照拟南芥等植物控制类黄酮合成的基因保守序列设计引物，对扩增片段进行测序并进行BLAST分析。【结果】有13对引物扩增的17个基因拷贝与参考基因序列相符，这些克隆属于13个已知功能基因，其中查尔酮合成酶基因有3个不同的基因拷贝，花色素形成（Production of anthocyanin pigment）基因和查尔酮异构酶基因分别有2个不同的基因拷贝，其余引物的扩增只获得一个拷贝。在GenBank数据库中进行检索表明，所克隆的基因拷贝中的DNA结合/转录因子基因(TT2、TT8、TTG2) 、花色素形成基因（PAP）和黄烷酮-3-羟化酶基因（TT6），在芸薹属植物中未见报道。【结论】克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因拷贝为阐明油菜种皮颜色形成的遗传调节奠定了基础。     

东湖F1代BMPR-1B和BMP15基因多态性 与产羔性能关联性分析

为探究候选基因BMPR-1B、BMP15与东弗里生羊♂和湖羊♀的杂交F₁代（东湖F₁羊）产羔数间的关联性,评估东弗里生羊作为引入品种的经济利用价值,使用PCR-RFLP技术对东湖F₁羊和湖羊的BMPR-1B、BMP15基因多态性与产羔数进行关联分析。结果显示,东湖F₁羊与湖羊群体内均未检测出BMP15基因的FecX^I突变。BMPR-1B基因FecB突变位点在湖羊群体中检测出AG、GG两种基因型,基因频率分别为0.064和0.936,优势基因型为GG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.032和0.968,优势基因为等位基因G;在东湖F₁羊群体中检测出AA、AG和GG 3种基因型,基因频率分别为0.146、0.683和0.171,优势基因型为AG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.488和0.512。表明对产羔有利的G等位基因可以通过东弗里生和湖羊杂交遗传给后代,可作为其分子育种的辅助选择标记。湖羊AG型与GG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）,东湖F₁羊 GG型、AG型个体产羔数极显著高于AA型个体（0.01＜P＜0.05）,GG型与AG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）。结果表明东湖F₁羊产羔数与BMPR-1B基因显著相关。     

陕北黄芥黄籽基因IP标记的开发

以(吴旗黄芥×武功芥菜)F₂代群体为材料,在前期研究基础上利用拟南芥、芸薹属基因组上已知的序列信息,发展与陕北黄芥粒色基因紧密连锁更近的内含子多态性(Intron Polymorphism,IP)标记。研究表明,在陕北黄芥黄籽基因与拟南芥基因组3号染色体的同源区域At3g14120~At3g29615内设计4对引物,发现At3g23030处的IP标记与黄籽基因连锁。将前期黄籽基因遗传连锁图谱上一个最近的AFLP标记EA02MC08侧翼序列利用PCR walking技术延长, 经BLAST分析将该标记成功定位到白菜A基因组A1染色体的BAC克隆（KBrH105I15）上,并根据此克隆序列设计10对引物进行IP标记开发,找到2对(Y3、Y7) IP标记与黄籽基因连锁。     

白菜型冬油菜与芥菜型油菜远缘杂交亲和性分析

采用蕾期人工剥蕾授粉方式,分别对白菜型冬油菜与芥菜型油菜进行种内、种间杂交,用荧光显微镜观察杂交后的花粉 柱头组织,同时用TTC染色法检测花粉活力,分析亲和性。结果表明,白菜型冬油菜品种内姊妹交、白菜型冬油菜种内不同品种杂交、芥菜型油菜与白菜型冬油菜种间杂交、白菜型与芥菜型油菜种间杂交亲和指数依次为0.350、0.117、0.113、0.037;试验中不同处理的花粉 柱头互作难易程度表现为白菜型冬油菜品种内姊妹交>白菜型冬油菜种内不同品种杂交>芥菜型油菜与白菜型冬油菜种间杂交>白菜型与芥菜型油菜种间杂交;花粉活力鉴定结果与花粉 柱头互作难易程度次序基本相似。白菜型冬油菜与芥菜型油菜正反交的亲和性,以芥菜型油菜作为母本亲和指数较高。     

甘蓝种和芥菜型油菜细胞质的遗传多样性

对36份供试材料（15份甘蓝种材料、12份芥菜型油菜、4份不同细胞质类型的甘蓝型油菜、2份白菜型油菜及黑芥、埃塞俄比亚芥、芸芥各1份）进行叶绿体和线粒体SSR分析。7对多态性叶绿体特异的SSR引物在参试材料中共检测到31条多态性条带,每个位点等位基因为3~8个,平均4.43个,PIC值为0.234~0.711,平均为0.550。 2对线粒体特异的SSR引物检测到多态性条带数分别为3和5,PIC值分别为0.409和0.558。将线粒体与叶绿体的SSR标记合并,36份材料的遗传相似系数为0.538~1.000,在遗传相似系数 0.700 处,36份材料可明显分为5类,分别为芥菜型油菜、甘蓝型油菜和白菜型油菜、埃塞俄比亚芥和黑芥、甘蓝、芸芥,结果与传统的分类一致。芥菜型油菜内存在4种单倍型,而甘蓝仅有一种单倍型,芥菜型油菜材料间的细胞质遗传多样性高于甘蓝种材料间的细胞质多样性。     

铅铜复合胁迫对芥菜子叶抗性的影响

【目的】研究不同质量浓度铅铜复合胁迫对芥菜子叶抗性指标的影响,为揭示重金属复合胁迫对植物抗性的影响机制提供参考。【方法】以超富集植物福州宽秆芥菜为试验材料,通过种子萌发试验,研究铅铜复合胁迫处理(对照(CK):0mg/L Pb(NO3)2+0mg/L CuCl2;处理1:100mg/L Pb(NO3)2+10mg/L CuCl2;处理2:200mg/L Pb(NO3)2+20mg/L CuCl2;处理3:300mg/L Pb(NO3)2+30mg/L CuCl2;处理4:500mg/L Pb(NO3)2+50mg/L CuCl2)对芥菜子叶中的可溶性蛋白质、可溶性糖、脯氨酸(Pro)、MDA含量和POD、SOD、CAT活性以及光合色素含量等指标的影响。【结果】随铅铜复合胁迫的加剧,芥菜子叶中的可溶性蛋白质和可溶性糖含量均呈先增后减的变化趋势,Pro和MDA含量较对照(CK)极显著增加,氧负离子产生速率呈增加趋势,POD活性呈先升后降趋势,SOD活性呈逐渐上升趋势,CAT活性呈逐渐降低趋势,芥菜子叶中的叶绿素a和叶绿素a+b呈先增加后减少趋势,而叶绿素b和类胡萝卜素含量则呈递减趋势。【结论】在受到铅铜复合胁迫时,芥菜的抗逆性降低,但同时也对较低质量浓度铅铜胁迫表现出一定的抗性。     

芥菜型油菜再生体系的影响因素

对新疆芥菜型油菜４个单、双低吕系子叶柄再生频率的影响因素进行了研究,其中子叶柄日龄、６－ＢＡ、ＡｇＮＯ３、卡那霉素浓度及基因型等因素对不定芽的再生率有很大影响。试验结果表明：萌发４～５ｄ的幼苗子叶柄再生频率最高;６－ＢＡ、ＡｇＮＯ４对不定芽分化的促进效果在不同品系中有大差异,通常浓度为４～６ｍｇ／Ｌ。不同品系对卡那霉素的耐受力有很大不同,其中新９５－Ａ在Ｋａｎ１５ｍｇ／Ｌ时仍有４．１７％的绿苗率;     

钒胁迫下枸杞和芥菜幼苗蛋白的分子分布研究

通过G-75凝胶层析结合电泳分析,研究了不同V(Ⅴ)浓度胁迫下枸杞和芥菜的蛋白分子分布。经过凝胶层析后出现两个紫外吸收峰,第一峰主要集中在8号至15号管,第二峰集中在25号至33号管。对第一紫外吸收峰的电泳分析表明,V胁迫下植物蛋白的分子分布发生了变化:当V浓度为10 mg·L~(-1)时,枸杞根产生了分子量为58.6 KD蛋白,茎产生了分子量分别为64.5、46.9KD两种蛋白;当V浓度增大到20 mg·L~(-1),叶产生了分子量为20 KD蛋白。随着V胁迫浓度增大,芥菜中分子量为33.9 KD和36KD两条蛋白条带逐渐变浅,而27.3 KD蛋白条带逐渐加深。枸杞幼苗第一洗脱峰蛋白中V含量随V胁迫浓度增大而增加,而芥菜叶在V≥10 mg·L~(-1)时V含量降低。这与不同植物蛋白结合V的能力有关,因枸杞幼苗蛋白结合V的能力较强,生成的植物螯合肽较多,故对V有较强的耐受能力。     

单嘧磺酯钠诱导芥菜型油菜雄性不育的作用效果

以3份不同芥菜型油菜自交系为材料,研究单嘧磺酯钠(MES)对芥菜型油菜的杀雄效果,同时利用细胞学观察对芥菜型油菜花粉败育特征进行探讨。结果表明,植株叶片喷施0.075 mg/L和0.1 mg/L的MES均能引起芥菜型油菜不育,高质量浓度的MES处理对农艺性状的影响更显著,细胞学观察发现MES诱导的芥菜型油菜雄性不育与绒毡层发育异常相关。研究结果为MES对芥菜型油菜的最佳杀雄浓度提供参考,并为其化学杀雄育种工作奠定理论基础。     

氮素水平对宽杆芥菜幼苗生长及酶活性的影响

以NH4NO3作为变量,试验设7个处理,以普良尼柯夫配方营养液进行试验来研究氮素对芥菜幼苗生长及酶活性的影响。水培试验结果表明,芥菜幼苗移栽后14 d,营养液中的总氮量为9 mmol.L-1(N3处理)的株高、叶数、最大叶长和最大叶宽均最大,分别为4.03 cm、3.00片.株-1、2.43 cm和1.08 cm,与N0处理的差异均达到极显著水平。芥菜苗移栽后42 d,以N3处理的株高、叶数、最大叶长、地上部、地下部、总生物量、根系活跃吸收面积和最长根长均最多,分别为4.30 cm、5.00片.株-1、3.36 cm、367.87 mg、27.13 mg、395.00 mg、53.03%和6.03 cm,它们与N0的差异均达到极显著水平,除最大叶长与N0处理的差异达到显著水平外。N3处理叶片的CAT和POD活性均较高,分别为16.89 U.mg-1.min-1和134.27 U.mg-1.min-1,MDA含量最小(2.29 nmol.g-1),与N0的差异均达到极显著水平。因此,在本试验条件上,营养液中的总氮量为9 mmol.L-1(N3)处理芥菜的幼苗生长和酶活性指标最好。建议营养液中施总氮量为9 mmol.L-1。     

唐菖蒲复色花突变体AFLP及SCAR标记研究

通过AFLP分子标记方法,应用16个引物组合对唐菖蒲M3突变体和对照株进行基因组序列多态性检测,发现有4对引物扩增出稳定的重复性好的多态性条带,4条特异带暂命名为E4M7304、E6M3202、E6M8258和E8M5268.其中E6M8258和E8M5268为对照缺失条带,其他2条为M3缺失条带.将这些特异性条带回收、克隆、测序,设计SCAR引物进行单株验证,其中E4M7304标记已经转换成了稳定的SCAR标记.由于唐菖蒲从子球到开花种球的繁殖年限较长,故可利用该SCAR标记对唐菖蒲的花色变异突变体后代进行早期分子鉴定,以提高育种效率.     

与茄子果皮颜色相关联的AFLP及SCAR标记

 【目的】寻找与茄子皮色或果皮花青素合成相关基因连锁的分子标记,检验混合品系法（bulked lines analysis）在筛选分子标记中的应用。【方法】采用AFLP技术,以具有不同果皮颜色的茄子及近缘种为材料,采用单株检测和混合品系法分别筛选与茄子果皮颜色相关基因连锁的分子标记。【结果】对58份高代自交系材料进行单株检测（亲缘关系分析）,筛选到了1个与茄子紫红、紫黑果色相关的共显性标记。测序结果表明,片段长度分别为107和108 bp,为发生插入/缺失突变的同源序列;将其转化为SCAR标记,对136份茄子材料进行验证,在其中111份紫红、紫黑皮色材料中,相关符合率为90%,在白色及绿色材料中表现为不规律分布。最后以混合品系法,在两池内进一步筛选到了6个多态性标记,对6个标记进行单株验证,确定了它们与紫红、紫黑果色相关。【结论】本试验所获得的SCAR标记、AFLP标记可以用于茄子果色分子标记辅助育种。