湖北省高热病猪链球菌的分离鉴定和对小鼠的致病性研究

 【目的】从湖北省不同地区的高热症病例猪的心血、肝、淋巴结、肾和肺等分离出11株链球菌,进行血清型、毒力基因分布和病理学的初步研究。【方法】通过ATB自动生化鉴定系统Rapid ID 32 STREP链球菌鉴定、PCR分型、毒力基因的PCR检测及动物试验对分离菌株进行试验。【结果】11株均为猪链球菌,其中1株为7型,2株为9型,另8株为其它型,没有1型和2型。对11株猪链球菌的mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh6种毒力基因的分布情况进行PCR检测及动物试验表明：致病性和致死性较强的菌株毒力基因表型多为epf+orf2+fpbs+gdh+,显示除mrp、sly外,其它毒力因子也与菌株毒力相关。病理学变化表明急性死亡多表现为急性败血症症状,全身各组织器官广泛出血,以及肺炎、肾炎,脾脏淤血水肿和淋巴结脓肿。【结论】湖北省存在7型和9型的猪链球菌感染,猪链球菌在高热症中具有一定致病作用。     

东莞某屠宰场猪链球菌检测及分离鉴定

【目的】猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种重要的猪病原菌,也是一种人兽共患病病 原体。其中猪链球菌 2 型（SS2）致病力最强,不但引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎甚至死亡,也可 导致人的感染和死亡。为评估屠宰场猪链球菌的传播风险,对东莞某屠宰场进行猪链球菌的采样检测和分离 鉴定。【方法】采集 40 头猪的关节液和扁桃体进行 PCR 检测和猪链球菌分离,分离菌分别进行形态学和生 理生化鉴定、16S rDNA PCR 扩增、分型 PCR 检测和抗生素敏感性试验。【结果】 对 40 头猪的关节液和扁桃 体提取 DNA 进行 PCR 检测,在 40 份关节液中,猪链球菌阳性率为 22.5%,但未检出猪链球菌 2 型阳性;在 40 份扁桃体样品中,猪链球菌阳性率为 32.5%,其中猪链球菌 2 型阳性率为 7.5%。从 40 头猪的扁桃体和关 节液共 80 份样品中分离出 3 株猪链球菌, PCR 结果表明,3 株分离菌中 1 株为猪链球菌 4 型,基因型为 epfmrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-;其他 2 株为猪链球菌 9 型,基因型分别为 epf-mrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly- 和 epf-mrp-gdh+gapdh+fbps-orf2+sly+。药敏试验表明,3 株猪链球菌菌株对青霉素 G、林可霉素、多粘菌素 B 和磺胺异恶唑耐药,对恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素和阿莫西林敏感。【结论】该屠宰场猪群中存在猪链球 菌的隐性感染,提示存在猪链球菌 2 型感染人的风险。     

贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析

目的:调查分析贵州省铜仁地区的猪群中猪链球菌2型的带菌情况和毒力因子的分布情况。方法:研究采用从贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本,对分离菌株进行培养,通过生化鉴定确定当地的猪群带菌情况,并使用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行检测。结果:检测显示,150例样本中2型猪链球菌带菌率达到41.3%,其中屠宰场3的检出率较高,mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%,屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。结论:该地区猪群猪链球菌2型携带率较高,mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。     

屠宰生猪体内猪链球菌2型带菌情况调查

应用猪链球菌2型定型PCR方法,对从福建省3个屠宰场采集的临床健康的生猪鼻咽拭子样本共121份进行了检测,同时对阳性样本进行了细菌分离鉴定及毒力基因检测。结果显示：121份样本中有17份为阳性,检出率为14．0％（17／121）,其中福州地区检出率为10．9％（7／64）,宁德地区检出率为11．8％（4／34）,莆田地区检出率为26．1％（6／23）。3株分离菌cps2J基因PCR特异性扩增产物大小均为675bp,其核苷酸序列与Genebank中猪链球菌2型参考菌株的同源性高达98％～100％,毒力基因型为gdh^＋／cps2J^＋／mrp^＋／ef^-／sly^-／fbps^＋／orf2^＋。调查结果表明,福建省福州、宁德、莆田等地区生猪群中均存在猪链球菌2型携带者,所分离到的3个猪链球菌2型菌株其毒力基因型为新的基因型。     

用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）菌株致病力各异，以斑马鱼为实验动物，建立了较为简便可靠的SS2致病力检测方法。【方法】选用1 005尾AB系斑马鱼（Danio rerio）以检测SS2不同分离株的致病力。检测8株基因型均为mrp+ef+、对猪有致病力的SS2菌株。【结果】结果斑马鱼接种菌株12 h后呈败血症病变，96 h内对斑马鱼的半数致死量（LD50）在5.36×103至5.01×104 cfu之间。上述接种菌株的斑马鱼均从体内重新分离到接种菌。同时检测1株基因型为mrp-ef-、对猪无致病力的SS2菌株，斑马鱼接种后96 h内不表现任何病变，亦不出现死亡，对斑马鱼的LD50>106 cfu。SS2有毒力株和无毒力株对斑马鱼的LD50差异极显著（P＜0.01）。【结论】斑马鱼可作为研究猪链球菌2型菌株感染的动物模型。     

四川鲟源海豚链球菌的毒力基因谱及分子分型

【目的】明确四川鲟源海豚链球菌Streptococcus iniae的毒力谱及分子流行病学特点,为鲟海豚链球菌病的防控提供参考。【方法】对四川地区17株鲟源海豚链球菌以及海豚链球菌ATCC29178进行毒力基因多重PCR检测,并通过随机扩增多态性DNA(RAPD)和重复序列PCR(REP-PCR)分析进行分子分型。【结果】所有菌株的7个主要毒力基因pgm、 scpI、 simA、 cpsD、 sagA、 pdi和cfi均为阳性,部分菌株的simA基因发生了变异。基于RAPD分析,18株菌分为Ⅰ、Ⅱ2个基因型;基于REP-PCR分析,18株菌分为A、B、C、D 4个基因型。【结论】四川地区17株鲟源海豚链球菌分离株均为强毒株,毒力谱为pgm/scpI/simA/cpsD/sagA/pdi/cfi,并且同时存在多种基因型的菌株,其中D型为优势流行型。     

东南地区猪圆环病毒2型检测及分子流行病学分析

【目的】分析我国东南地区2012－2018年规模化猪场猪圆环病毒2型（PCV2）的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳（Cap）蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%（272/649）。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型; PCV2e毒株检出率较低（仅为0.46%）,其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低（91.0%~93.0%）。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集521份患病猪组织样本进行PRRSV检测。对样本进行ORF5基因测序,采用DNAStar分析ORF5核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用Mega7.0构建基于ORF5基因的系统遗传进化树。【结果】从37个猪场采集的样品PRRSV阳性率为24.4%,猪场阳性率为45.9%。通过测序分析获得17株来自不同猪场的PRRSV ORF5基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株（PRRSV 2）,其中有5株属于Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like）谱系,9株属于Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like）谱系,3株属于Lineage 3(QYYZ-like)谱系,没有监测到Lineage 5(VR2332-like)谱系的毒株。17株PRRSV毒株的...     

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp epf ) ,1株为 mrp epf- ,1株为 mrp- epf- 。     

猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征

为了研究国内致病性猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的毒力因子分布特征,本试验选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2,设计并合成7对引物,用PCR方法进行检测。结果显示:25株猪链球菌2型(SS2)国内分离株,96%(24/25)表现为cps /gdh /epf /mrp /sly /fbps /orf2 ,仅1株表现为cps /gdh /epf-/mrp /sly /fbps /orf2 ;1株猪链球菌1型(SS1),表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;1株猪链球菌7型(SS7)国内分离株,表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;2株猪链球菌9型(SS9)国内分离株,均表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2 ,可见国内SS2的毒力基因分布特征与欧美等国家明显不同,提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。     

两株猪链球菌血清9型菌株的生物特性分析

为了解猪链球菌血清9型菌株KQ-1株、KQ-2株的生物特性,对其进行了菌种鉴定、生长曲线绘制、毒力因子鉴定和小鼠致病性试验.首先采用革兰氏染色、PCR鉴定的方法对2株菌进行菌种鉴定,然后利用猪链球菌的主要毒力基因mrp、epf、sly、gadph、orf2、fbps、89k的引物对2株菌的毒力基因进行鉴定;将2株菌在TSB培养基(含10％新生牛血清)中进行培养,绘制其生长曲线,初步了解这2株菌的生长特性;选取45只健康的昆明鼠注射2株菌的菌液,进行致病性试验,了解其致病性.结果显示,KQ-1株、KQ-2株革兰氏染色呈阳性,PCR鉴定结果为猪链球菌血清9型;2株菌均在37℃培养6 h时菌液密度达到最高值.对2株菌毒力基因的鉴定结果如下:KQ-1株的基因型为mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-,KQ-2株的基因型为mrp-/epf-/sly-/gadph+/orf2+/fbps-/89k-;对2株菌的小鼠致病性试验表明,2株菌均为强毒株.     

奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

【目的】研究奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌HPI携带情况及其与O血清型的关系,并对部分菌株的相关基因序列进行分析。【方法】从中国北京、内蒙古、甘肃、四川、重庆、云南、贵州等7个省市部分地区1 260份临床型和隐性奶牛乳腺炎奶样中分离得到190株大肠杆菌,对分离菌株进行耶尔森菌强毒力岛核心区irp2基因、fyuA基因及HPI毒力岛在大肠杆菌染色体中插入位置的鉴定,分析HPI毒力岛的携带情况及其与分离菌株O血清型之间的关系。【结果】190株大肠杆菌分离株中,irp2基因阳性率为26.31%（50/190）,fyuA基因阳性率为18.94%（36/190）。50株HPI+分离株中检出asn_tRNA_intB 基因32株,阳性率为64%（32/50）。本试验克隆的irp2基因(273 bp）、fyuA基因(1 071 bp）、asn_tRNA_intB基因(1 512 bp）均与已发表序列高度同源,同源性分别在97.1%、98.2%、97.2%以上,且其HPI毒力岛大多位于大肠杆菌染色体的asn_tRNA位点上。【结论】耶尔森菌HPI在奶牛乳腺炎源大肠杆菌中广泛流行分布,但也存在差异,而不同血清型菌株携带HPI的倾向性可能只与特定的血清型有一定的关系。     

张家川县牛、羊梨形虫病流行情况调查与分析

为了解张家川县牛、羊梨形虫病的流行情况,该研究于2020年3—7月份,选择张家川县15个乡镇为采样点,分别采集牛、羊血液涂片、血清及抗凝血样本,通过血液涂片吉姆萨染色镜检、酶联免疫吸附试验（ELISA）及聚合酶链反应（PCR）分析张家川县牛、羊梨形虫病的流行趋势、流行原因。结果显示：被调查的120份血液涂片样本中,梨形虫病总阳性率达30.83%,其中牛阳性率为6.67%、羊阳性率为38.89%; 677份血清样本,抗体总阳性率46.09%,其中牛阳性率为37.33%、羊阳性率为52.73%; 43份抗凝血样本,扩增阳性率为46.51%,其中牛阳性率30%、羊阳性率51.5%。可见,牛、羊梨形虫病在该县流行非常广泛,也非常严重,该地区需及时提高对梨形虫病危害和防控的认识,加强对梨形虫病的防治力度。     

粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测及致病性初步研究

采用PCR方法对56株仔猪黄白痢源大肠杆菌肠毒素和耶尔森菌强毒力岛(HPI)相关毒力因子STa、STb、LT和irp2进行检测,进而根据毒力因子基因型对部分菌株进行致病性试验。结果显示,38株受试菌检测到毒力因子,其中STa基因阳性率为3.57%,STb基因阳性率为53.57%,LT基因阳性率为7.14%,irp2基因阳性率为21.43%,检测的毒力因子表现为5种基因型,主要的毒力因子基因型是STb和STb+irp2。致病性试验显示毒力基因阳性菌株均对小白鼠具有致病性。结果表明,粤北地区致仔猪黄白痢大肠杆菌流行的主要毒力因子为STb,其次为irp2、少数菌株携带STa和LT毒力因子,相关毒力基因检测可以作为快速确定大肠杆菌致病性的重要依据。     

陕甘地区猪PCV3流行毒株的检测

【目的】调查陕甘地区猪场PCV3流行情况,为进一步研究与防控PCV3奠定基础。【方法】根据GenBank中PCV3基因序列,设计并合成了1对引物,对96个猪场的96份混合样本进行PCV3检测,将阳性样品进行序列测定分析,同时对PCV3阳性样品进行6种常见猪群病毒病检测。【结果】检测出了PCV3阳性样品8份,阳性率为8.33%。其中7份样品与其他6种常见猪群病毒存在不同程度的混合感染现象,混合感染率87.5%。序列分析表明,陕甘地区猪场8株PCV3基因片段核苷酸同源性在98.3%～100%,与不同地域参考毒株的同源性在97.6%～100%。【结论】陕甘地区2015年样品中即存在PCV3感染,不同地区的PCV3基因同源性较高,遗传稳定;基因进化树显示不同地域PCV3毒株交叉分布,没有明显的地域特征。     

江西省5个规模化猪场健康猪群中猪链球菌的流行病学调查及耐药性研究

【目的】调查猪链球菌在江西省规模化猪场的临床健康猪群中的流行现状和耐药情况。【方法】选取2017—2019年江西省的5个规模化猪场为采样点,采集表观健康猪群鼻拭子314份,采用选择性培养基与分子生物技术的方法进行猪链球菌的分离鉴定,并通过Kerby-Bauer纸片扩散法测定分离菌株对16种抗生素的耐药性。【结果】分离鉴定出猪链球菌112株;表观健康猪群中的猪链球菌总检出率为35.67%,各个规模化猪场的检出率统计学差异显著;未检测出猪链球菌2型,检出率0%;50%以上的猪链球菌菌株对克林霉素、四环素、红霉素和克拉霉素等耐药,90%以上的猪链球菌菌株对万古霉素、青霉素G和米诺环素高度敏感;菌株的耐药谱以多重耐药为主,甚至分离到耐11种和12种抗生素的猪链球菌菌株;不同地域猪场猪链球菌的耐药性和耐药谱差别较大。【结论】猪链球菌在江西省内的规模化猪场中流行率较高,青霉素是目前理想的治疗或预防猪链球菌病的首选药物,但是目前猪链球菌的耐药情况,特别是多重耐药情况已相当严峻,迫切需要引起从业人员的重视,建立完善合理的猪链球菌病防控方案。     

多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子

根据猪链球菌基因序列,设计合成10对引物,通过在3个反应体系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的组合优化,建立涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的快速敏感的多重PCR检测方法.对不同菌株检测结果显示,该多重PCR方法特异性强、敏感性高,能快速检测出猪链球菌2、7、9型及其毒力因子表型,可用于快速诊断及猪链球菌的分子流行病学调查.     

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1 475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1 172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株...     

2014—2016年广东省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查

【目的】研究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行情况。【方法】2014—2016年共采集广东省各规模化猪场猪组织样品1 137份进行抗原检测,血清样品9 432份进行抗体检测。对不同年份、不同季度、不同区域的PRRSV抗原抗体检测情况进行比较分析,对分离的病毒进行遗传进化分析。【结果】2014、2015和2016年的PRRSV抗原阳性率分别为30.86%、34.35%、37.50%;抗体阳性率为82.86%、68.87%、74.56%。从季度分析来看,第1季度抗原阳性率最高,为40.27%;第2季度抗原阳性率最低,为28.66%;各季度抗体水平均在70%以上。不同区域间的PRRSV感染率差异明显,粤东粤西感染率显著低于珠三角和粤北;在抗体水平上,粤东地区较低,抗体阳性率为69.51%,其他3个区域均高于75%。抗原检测阳性的样品中共分离到69株PRRSV毒株,其中有39株位于Subgenotype I亚群。【结论】广东地区PRRSV抗原阳性率呈逐年上升趋势,抗体水平较高但并不稳定,从病毒分离结果看,Subgenotype I亚群为省内主要流行亚群。     

四川兔源金黄色葡萄球菌毒力检测及分子分型

【目的】研究四川部分区域兔源金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的基因型总体结构特征、遗传变异以及毒力因子的分布情况。【方法】从四川地区分离41株兔源金黄色葡萄球菌,鉴定fem B基因特异性,进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)筛选,并通过PCR法检测13种常见的毒力基因,采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)和脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)确定基因型特征。【结果】41株金黄色葡萄球菌中共检测出MRSA 31株,检出率为75.61%;共检出9种毒力基因,其中nuc、hla、eta和clf A在所有菌株中均存在,而sea、sec、see、hlb和PVL的阳性检出率分别为9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%。MLST分型结果显示,41株金黄色葡萄球菌只存在2种序列型(ST398、ST3320)和1个克隆群CC398,其中ST398为优势序列型,所占比例为97.6%。PFGE将41株金黄色葡萄球菌分为18个基因型,但不同区域间的基因型条带差异较小。【结论】四川调查区域兔源金黄色葡萄球菌毒力因子携带率较高,其对家兔的养殖业存在较大的安全威胁;分型分析说明四川部分区域金黄色葡萄球菌的主要流行菌株遗传变异程度小,菌株间亲缘关系较近。