青枯假单胞菌的一段12.8kb DNA带有特异性控制病菌在花生上致病的基因

在本工作中,通过平板筛选分离得到两个来自马铃薯的青枯假单胞菌菌株Ｔ２００２和Ｔ２０５３（对花生不致病）的利福平抗性自发突变株Ｔ２０１６和Ｔ２０１７,通过三亲本接合,ｐＧＸ１２５２分别以９．０７×１０－７、２．５４×１０－６频率被导入到Ｔ２０１６和Ｔ２０１７中,所得接合子Ｔ２１２３（Ｔ２０１６／ｐＧＸ１２５２）和Ｔ２１２４（Ｔ２０１７／ｐＧＸ１２５２）均分别能使花生汕油５２３发生青枯病,但它们侵染的植株出现病症的时间比Ｔ２００５晚３～５ｄ,说明ｐＧＸ１２５２能扩大Ｔ２０１６和Ｔ２０１７的寄主范围使之包括花生。从侵染Ｔ２１２３、Ｔ２１２４的病株中重新分离病菌,四环素抗性检测和质粒检测表明所有细菌均含有ｐＧＸ１２５２,说明在植物体内无抗生素选择压力情况下ｐＧＸ１２５２能在Ｔ２０１６、Ｔ２０１７中稳定存在。本工作进一步证实ｐＧＸ１２５２带有特异性控制青枯假单胞菌在花生上致病的与寄主专一性有关的基因。     

导入外源基因扩大青枯假单胞菌的寄主范围

应用广谱寄主载体pLAFR1,在大肠杆菌中建立了青枯假单胞菌Pseu-domonas solanacearum两个不同生理小种T2003(在马铃薯上高发病,在花生上不致病)和T2005(在花生上高发病)的基因文库。把菌株T2005基因文库的克隆转移至T2003受体中,结果得到两个能引起花生枯死的结合子,这表明通过导入菌株T2005文库中的两个克隆,使原来在花生上不致病的菌株T2003的寄主范围扩大到在花生上能致病。     

青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)中的一条多拷贝质粒

在青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)菌株T1001中,发现了一条高拷贝质粒pPS1GX,其拷贝数目约为15,线性长度为3.4kb,不具有EcoR1,BamH1,Hind皿,Bg1Ⅱ,KpnⅠ,PvuⅡ,SstⅠ等限制性内切酶位点,而只有一个PstⅠ和XhoⅠ位点,因而pPS1GX在组建适用于青枯假单胞菌的稳定克隆载体上是有用的。     

冷却肉中假单胞菌温度预测模型的建立与验证

为了快速预测和监控引起冷却肉腐败变质的主要微生物--假单胞菌的生长,以从冷却猪肉中分离得到的假单胞菌P-1菌株作为受试菌,建立和验证0～10℃低温条件下假单胞菌的生长动力学模型.利用SAS程序拟合不同温度条件下的生长情况,经过比较发现,Gompcrtz模型比线性模型能更好地拟合假单胞菌的生长,从而得到假单胞菌生长的Gompcrtz模型参数;利用平方根模型对假单胞菌的最大比生长速率平方根一温度进行拟合,得到假单胞菌生长的二级模型:利用培养基数据、冷却肉产品数据和温度波动条件下的数据对所得到的二级模型进行验证,计算得到总的偏差因子和准确因子分别为0.944和1.256,结果表明建立的二级模型能真实快速有效地预测0～10℃下冷却肉中假单胞菌的生长.     

荧光假单胞菌诱导番茄抗枯萎病的ISR研究

本文采用实时荧光定量PCR技术对荧光假单胞菌PEF-5#18诱导番茄系统性抗性(ISR)的作用机理进行了研究,包括了诱导进程中番茄根系病程蛋白基因PRs族、GR等重要防卫基因以及乙烯、水杨酸、茉莉酸等诱导信号调控路径的关键基因的表达情况。结果表明,尖孢镰刀菌Forl和荧光假单胞菌PEF-5#18对番茄植株分别具有SAR和ISR诱导抗性能力,而在"Forl-番茄-PEF-5#18"互作模式下,番茄植株受诱导所产生的抗性则受到SAR和ISR共同作用的影响;与对照相比,Forl或荧光假单胞菌PEF-5#18均能诱导番茄病情蛋白基因PRs (PR1、PR4、PR5、PR6)与GR、POX、PAL等相关防卫基因的表达进行上调,而相关受诱导基因的表达程度与动态变化则与所诱导的SAR和ISR抗性反应类型以及诱导时间有关;此外,对于调控路径的分析结果显示出尖孢镰刀菌Forl对番茄SAR诱导抗性主要依赖于水杨酸路径进行调控,而荧光假单胞菌PEF-5#18对番茄ISR诱导抗性则主要依赖于茉莉酸和乙烯路径来调控。     

硅介导番茄青枯病抗性的土壤定量蛋白质组学研究

番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的经济作物。由青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染所产生的青枯病是一种严重影响茄科类作物的细菌性土传病害。传统的防治方法,如培育抗性品种、轮作、药剂防治等均存在一定的局限。而硅作为一种作物生长的有益元素,在提高植物适应生物胁迫和非生物胁迫中均起重要作用。本研究以易感青枯病的番茄品种"台湾红圣女"作为试验材料,利用i TRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)定量蛋白质组学技术,研究硅和/或青枯菌接种对番茄青枯病抗性及土壤蛋白质组的影响。结果表明,2.0 mmol L-1硅处理能显著降低番茄青枯病的病情指数,增强抗病性。基于i TRAQ定量蛋白质组学技术,硅和/或青枯菌处理对土壤蛋白质组的研究表明,在鉴定的30个土壤蛋白质中,有29个蛋白差异表达显著(上调≥1.2倍,下调≤0.8倍差异)。青枯菌侵染诱发22个土壤蛋白下调表达,5个上调表达。在不接菌的条件下,硅处理有5个土壤蛋白上调,19个蛋白下调;而接菌条件下则有8个蛋白上调,14个蛋白下调。将这29个差异蛋白进行GO基因功能分类结果显示,硅和/或青枯菌处理主要影响生理代谢过程以及核酸结合蛋白。硅对番茄青枯病的作用机理主要体现在:改变微生物的代谢能力,调控与抗性代谢、蛋白质的合成与翻译、信号转导以及免疫系统过程和胁迫响应有关蛋白的表达,影响钙离子信号转导等。     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

作物轮作对土壤中烟草青枯菌数量及发病的影响

为查明春烟换茬后青枯菌在土壤中的消长规律, 采用接种耐药性青枯菌的盆土种植烟草, 烟草枯死后种植不同轮作作物的方法, 研究不同作物对土壤中青枯菌数量及其越冬状况的影响。设茄子、大豆、花生、甘薯、大蒜、玉米、晚稻和双季稻8 个轮作物处理, 后作生长期间定期取样, 用含利福平的选择性培养基检测样品中的青枯菌数量。结果表明, 栽后第4 周起秋茄子和秋大豆根中皆测出青枯菌, 秋茄子根达10⁶ cfu·g^-1;晚稻和秋花生根只第2 周和第8 周测出带菌。秋茄子、秋大豆、秋花生和晚甘薯生长期间土壤皆测出青枯菌,数量先降后升至10⁴~10⁶ cfu·g^-1; 晚稻和秋玉米土壤中青枯菌数量持续下降; 大蒜处理先测出带菌后未测到。冬季对水稻残桩青枯菌数量监测显示, 稻桩根和土壤中青枯菌数量先后出现峰值, 分别达1.00×10⁵ cfu·g^-1 和5.17×10⁴ cfu·g^-1; 发现病菌能在稻根变黑腐烂时增殖。翌年春季从茄子、大豆、花生和甘薯茬口土壤中测出遗留青枯菌数量皆达10⁴ cfu·g^-1, 玉米为10³ cfu·g^-1。烟草移栽后青枯病调查表明, 不同处理发病迟早取决于茬口土壤中菌源数量, 两者相关系数r 为0.908 9。不同茬口土壤发病轻重有显著差异, 茄子茬土发病最重,病情指数100, 大豆和大蒜茬土发病略重于花生、甘薯和玉米茬土; 晚稻茬土发病最轻, 病情指数16.7, 与茄子茬土相比发病期推迟20 d, 病情指数下降83.3%; 双季稻茬土未见发病, 证明烟稻轮作对青枯病有较好的控制效果。     

丛枝菌根真菌提高感染青枯菌番茄根际土壤细菌群落多样性和稳定性及有益菌属相对丰度

  【目的】  青枯病是由茄科雷尔氏菌 (Ralstonia solanacearum, 亦称青枯菌) 诱导产生的一种高温高湿型土传病害,土壤温度高、湿度大时易于青枯菌的繁殖进而引发青枯病。丛枝菌根真菌 (arbuscular mycorrhiza, AM) 可能通过调控根际微生物区系对病原体产生影响,我们研究了AM真菌对青枯菌入侵条件下土壤细菌群落的影响。  【方法】  以番茄 (Solanum lycopersicum) 为试材进行盆栽试验,供试AM真菌为摩西管柄囊霉 (Funneliformis mosseae) M47V,供试病原菌为茄科雷尔氏菌QL-RS 1115 (GenBank:GU390462)。催芽5日的番茄种子,接种AM菌剂的为菌根苗,未接种AM真菌的为非菌根苗。在番茄幼苗生长30天时,一半菌根苗和非菌根苗接种青枯菌,另一半不接种青枯菌,共4个处理。在接种青枯菌后1天和14天,采集番茄样品,采用抖土方法采集根际土壤,利用实时荧光PCR分析番茄根际青枯菌数量,采用16S rRNA高通量测序探究土壤细菌群落多样性和结构稳定性。  【结果】  在接种青枯菌初期 (1天),非菌根苗接种青枯菌 (TR–AMF) 和菌根苗接种青枯菌 (TR+AMF) 两组处理的根际土壤细菌群落结构发生明显改变,Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数显著降低 (P<0.05),共现网络的节点数和连接数明显减少,模块化程度降低,共现网络简化表明细菌群落结构的稳定性降低。接种青枯菌14天后,不动杆菌属 (Acinetobacter)、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)、溶杆菌属 (Lysobacter)、假单胞菌属 (Pseudomonas) 等有益细菌属在感染青枯菌的番茄根际富集,细菌共现网络的节点数和连接数增加,模块化程度提高,表明细菌群落稳定性得到恢复。与非菌根苗相比,菌根苗接种青枯菌 (TR+AMF) 和菌根苗未接种青枯菌 (TN+AMF) 两个处理番茄根际土壤中青枯菌丰度显著降低 (P<0.05)。AM真菌显著提高Chao1指数和Shannon指数 (P<0.05),提高了感染青枯菌番茄根际土壤中黄杆菌属(Flavobacterium)、黄色土源菌属 (Flavisolibacter)、噬胞菌属 (Cytophaga) 和苔藓杆菌属 (Bryobacter) 的相对丰度,同时增加了共现网络的节点数和连接数,并促进番茄根际细菌物种之间的良性互作,提高细菌网络的复杂程度。  【结论】  感染青枯菌的番茄根际会富集不动杆菌属 (Acinetobacter)、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)、溶杆菌属 (Lysobacter)、假单胞菌属 (Pseudomonas) 等有益菌属以提高其抗病性,恢复细菌多样性和群落稳定性。接种AM真菌可显著降低番茄根际土壤中青枯菌的丰度,特别是侵染青枯菌后提高番茄根际的黄杆菌属 (Flavobacterium)、黄色土源菌属 (Flavisolibacter) 、噬胞菌属 (Cytophaga) 和苔藓杆菌属 (Bryobacter)的相对丰度,进而抑制土壤中青枯菌的生长,并通过提高细菌的多样性和丰富度,促进番茄根际细菌物种之间的稳定共生和良性互作,从而提高细菌群落对青枯菌的抵抗能力。     

假单胞菌的生物防治作用研究

假单胞菌能产生多种抗生素 ,改善植物营养 ,促进植物生长 ,且能降解土壤中有毒物质 ,对植物促生长防病作用显著。部分假单胞菌株具有杀虫功能 ,由假单胞菌可开发一系列生物防治产品