荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员基因克隆及生物信息学分析

为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制,选择荔枝古树"宋荔"花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料,采用同源克隆和RACE方法,获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列,并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质,将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明:该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质,定位于微体(过氧化物酶体)和细胞质,具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp,含7个内含子,其中第4个内含子较长,达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因,该可变剪接基因提前终止,仅编码207个氨基酸的蛋白质,将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。     

玉米谷氨酰胺合成酶基因家族的生物信息学分析

谷氨酰胺合成酶(GS,EC6.3.1.2)是氮素代谢途径中的关键酶,对植物的生长和发育至关重要。采用多种生物信息学软件对6个玉米GS基因的可变剪接现象、核苷酸序列、编码蛋白序列、磷酸化位点、基因组结构、同源进化关系以及启动子顺式作用元件进行系统的生物信息学分析。结果表明,5个玉米GS基因存在可变剪接现象,编码蛋白的氨基酸数目为356~423个;6个玉米GS蛋白存在19~38个的磷酸化位点,各成员基因组序列上含有10~15个外显子;玉米GS基因可划分为GS2、GS1-1、GS1-2和GS1-3等4个亚组;6个基因定位到1、4、5、9和10号共5条染色体上,6个成员的启动子区域含有MYB结合位点、水杨酸响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等重要的调控元件。     

茶树橙花叔醇合成酶CsNES基因两个可变剪接转录本的功能分析

茶树橙花叔醇合成酶CsNES是催化(E)-橙花叔醇生物合成的关键酶。基于茶树全长转录本及基因组数据分析显示,橙花叔醇合成酶基因CsNES除全长转录本外,还存在两个较短的可变剪接基因亚型。利用5′RACE方法验证了CsNES基因分别在第二、三个外显子上存在可变的转录起始位点,并命名为CsNES-2和CsNES-3。体外蛋白重组显示,CsNES-2和CsNES-3表达产物均能够催化底物法尼基焦磷酸FPP生成(E)-橙花叔醇。基因表达分析显示,CsNES-2和CsNES-3在花中的表达量较高,在叶片中的表达水平较弱,而在嫩叶中的表达水平显著高于成熟叶片。在激素GA和MeJA处理下,CsNES-2和CsNES-3能够被MeJA诱导并上调表达。结果表明,CsNES基因存在5′端可变剪接事件,且其可变剪接产物具有催化活性,这为后续研究基因可变剪接机制对茶树萜类代谢的调控有重要指导意义。     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

普通小麦花发育基因 TriFVE 的克隆与染色体定位

植物自主开花途径花发育基因FVE对植物营养生长向生殖生长的转变起重要的调控作用。为了进一步研究该基因在小麦中的调控功能,利用小麦基因组数据和二穗短柄草基因组数据,通过RT-PCR和PCR技术对小麦花发育基因FVE的DNA序列和cDNA序列进行了克隆和序列分析,分别获得了7 034bp(TriFVE1,Gene Bank JQ317687)和6 910bp(TriFVE2,Gene Bank JQ317688)的两个FVE基因序列。基因结构分析表明,FVE基因由15个外显子和14个内含子组成,TriFVE1和TriFVE2基因的内含子序列存在大片段的插入/缺失,同源性仅为79.87%。TriFVE1和TriFVE2的cDNA编码区序列均为1 368bp,存在4个SNP位点,编码455个氨基酸的FVE蛋白序列完全一致。利用"中国春"和21个缺四体将TriFVE1和TriFVE2分别定位于小麦3A和3D染色体上。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了FVE基因在单棱期、二棱期和穗分化时期的小麦茎尖组织表达模式,发现二棱期和穗分化期TriFVE的转录水平显著高于单棱期,表明FVE在小麦花发育由营养生长到生殖生长过程中起重要作用。基于FVE蛋白序列的系统进化树分析表明,苔藓植物、单子叶和双子叶植物被明显分为不同类群,该基因随着物种的进化而进化,可以为研究植物分子进化关系提供参考。     

小麦基因克隆研究进展

小麦的基因克隆研究主要集中在品质、抗病、抗逆性、光合、春化等几个方面。在品质方面，已克隆了编码小麦高、低分子量谷蛋白亚基的基因、小麦淀粉合成酶基因及编码黑麦碱的基因；在抗病、抗逆性方面，已克隆了6个与白粉病有关的cDNA、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因、抗小麦根节线虫基因、盐胁迫应答基因、水分胁迫诱导基因、与重金属解毒有关的基因；另外，还克隆了小麦叶绿体基因组中与光合作用有关的psbA基因和与春化有关的基因Vrc79、Vrc54、Vrc203、Vrcl7、Vrc28等。在小麦中还克隆到一个GTP结合蛋白的cDNA克隆、EIF转录因子的cDNA克隆及异构酶基因家族FKBP73基因的启动子序列。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

小麦自主开花基因TaFLD单核苷酸多态性分析

为了给培育具有广泛生态适应性的小麦品种提供参考依据,通过比对拟南芥自主开花基因(FLD基因)与小麦D基因组序列,获得小麦FLD基因的同源序列.分析结果表明,小麦TaFLD基因全长8 392 bp,具有3 087 bp完整ORF,编码1 028个氨基酸,亚细胞定位预测显示,其编码蛋白定位于细胞质.TaFLD基因功能预测表...     

小麦NAC转录因子的基因克隆与序列分析

为了深入研究小麦中NAC家族转录因子基因,针对NAC基因家族成员,设计了覆盖其全长编码区的1对特异引物,从陕253小麦品种中克隆了2条大小分别为1 463、1 549 bp的片段,命名为TaNAC2、TaNAC4( GenBank登录号为HQ872050HQ872051)。序列分析表明,这2个序列包含典型NAC的完整编码序列,包括两个内含子,具有完整的开放阅读框;推导的氨基酸序列分别为383、405个,这2个基因在N端均具有NAC基因的典型DNA结合结构域,即 NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的 A、B、C、D、E 5个亚区高度保守,仅在C亚区出现一个氨基酸的差异LM,而且在CD区出现罕见的半胱氨酸变异,此发现对于小麦品质的研究非常重要。同时发现这 2个NAC类转录因子都不含有核定位信号（NLS）,但是有相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,证实克隆序列属于NAC基因家族成员,并且发现的TaNAC4属于NAC转录因子家族的NAM亚组,TaNAC2属于NAC转录因子家族的CUC亚组。     

茄子冷诱导转录因子CBF的分离及分析

利用白菜CBF基因序列搜索茄子基因组DNA序列和茄子EST序列,然后参考这些序列设计开放型阅读框两端的特异引物,以茄子叶片cDNA为模板克隆获得了该基因的cDNA序列。经生物信息学分析证实该序列是CBF基因,命名为SmCBF（登录号：KY780486.1）。该基因编码211个氨基酸,包含AP2功能域和DNA结合位点,属于AP2超基因家族。用PlantCARE分析SmCBF基因启动子序列的顺式作用元件,发现了1个MYC识别位点和1个MYB结合位点,说明该基因受到MYC和MYB的调控。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达情况,结果显示该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高,在6 h达到最高值,说明低温诱导该基因表达。     

龙眼叶片PAL基因的克隆与表达研究

为获得龙眼PAL基因的序列，并研究该基因在转录水平的表达，采用反转录PCR获得PAL的保守序列，然后利用RACE法克隆PAL基因的3'cDNA和5'cDNA序列，再利用DNAMAN软件拼接获得PAL基因的cDNA全长序列。以actin基因作为内参进行实时荧光定量PCR，研究PAL基因在4个龙眼品种嫩叶中的表达差异。结果表明，克隆得到Dlpal基因的cDNA全长序列为2 532 bp，开放阅读框为2 101 bp，编码839个氨基酸，分子量为92.259 ku，等电点为7.38。BLAST比对结果显示，该序列与其它物种的PAL基因具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明，Dlpal基因在4个龙眼品种‘乌龙岭’、‘松风本’、‘立冬本’和‘石峡’的嫩叶间的表达量差异显著，其中在‘立冬本’中表达量最高，在松风本中表达量最低。初步证明PAL基因在不同品种的龙眼叶片中的表达量差异显著。     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

苋菜MDH基因克隆及生物信息学分析

[目的]对苋菜MDH基因进行克隆及生物信息学分析.[方法]以苋菜试管苗为材料,从实验室构建的苋菜转录组数据库中筛选出苋菜MDH基因的cDNA序列片段,采用RT-PCR技术对其ORF进行克隆,并进行生物信息学分析.[结果]MDH基因编码344个氨基酸,通过生物信息学分析表明,MDH可能为非分泌蛋白,包括33个磷酸化位点,...     

玉米ZmPRR1-1基因启动子的克隆及序列分析

克隆玉米伪应答调控基因ZmPRR1-1启动子并对其序列进行分析,以期为深入研究ZmPRR1-1基因的调控机制及基因功能提供参考。以玉米黄早4的叶片为供试材料,参考已公布玉米自交系CML247基因组中ZmPRR1-1启动子的序列信息设计引物,克隆ZmPRR1-1基因的启动子,并利用生物信息学对启动子中的核心区域、顺式作用元件、转录因子结合位点和CpG岛进行预测分析。克隆得到长度约2 600 bp的ZmPRR1-1启动子,预测ZmPRR1-1启动子可能存在2个核心启动子区域,除了存在核心元件TATA-box和启动子增强元件CAAT-box外,还存在光响应、激素应答、胁迫响应等顺式作用元件。转录因子结合位点分析表明,ZmPRR1-1启动子区中预测包含ERF在内的6种转录因子家族,此外在启动子区域中预测存在4个符合限定条件的CpG岛区域。玉米ZmPRR1-1启动子区域存在丰富的顺式作用元件和转录因子结合位点,暗示ZmPRR1-1可能受到外界多种类型调控因子的调控并启动转录起始,且在多种调控网络中发挥功能。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

玫烟色棒束孢几丁质酶基因上游调控序列克隆与结构预测分析

为探明玫烟色棒束孢几丁质酶基因Ifuchi1的表达调控机理，根据Ifuchi1基因组全长核苷酸序列，采用基因组步移方法，获得Ifuchi1的5′-上游区序列(总长为2 402 bp)。与cDNA 序列进行比对，其中含有2个内含子。TFSEARCH 1.3 软件分析转录因子结合位点的结果显示，该序列中没有明显的TATA和CAAT框，含有4个可能的碳调控因子的结合位点5＇>(g/c)YggRg<3＇和3个氮调控因子的结合位点-相隔很近的GATA。其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。本研究结果为深入研究玫烟色棒束孢几丁质酶基因的表达调控机制及其分子机理奠定了一定基础。     

大豆天冬氨酸途径关键酶基因GmASADH的克隆与分析

本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH 基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR 获得了约1130bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1（FJ581425）和GmASADH2（HM015631）。GmASADH1编码区长度为1134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann superfamily和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。     

豫麦34低分子量谷蛋白亚基一个新基因的克隆

为了解强筋优质小麦品种豫麦34的低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的基因构成,利用普通小麦LMW-GS基因特异引物,采用PCR扩增技术从中克隆得到一个LMW-GS新基因LMWY34(GenBank No.GU183486)。该基因具有LMW-GS基因的典型结构特征,编码区全长906 bp,编码302个氨基酸。推导氨基酸序列显示,LMWY34的编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,与已报道的GluD3-4位点编码的LMW-GS基因序列有很高的一致性(98.68%)。     

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控.本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1.序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02.进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近.组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高.另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片.