小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

棉铃虫para同源基因Ⅲ—Ⅳ接头DNA片段序列分析

利用反转录PCR技术,用一对特异性寡核苷酸引物,分离获得棉铃虫para同源基因Ⅲ-Ⅳ接头约300bpDNA片段,发现在BaoD-R和BaoD_S品系间存在4个核苷酸差异,但在推导的氨基酸组成上没有差别,对比分析表明,分离获得的棉铃虫Ⅲ-Ⅳ接头氨基酸组成与烟芽夜蛾hscp片段同一区域有98.1%的氨基酸相同,与德国蜚蠊CSMA的氨基酸有93.5%相同,与果蝇para基因有88.9%的氨基酸相同。     

赤拟谷盗β1-微管蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

本研究利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术对赤拟谷盗Tribolium casta-neum体内β1-微管蛋白(β1-tubulin)基因进行了克隆,获得的基因(EU555191)全长为1573bp,包含1344bp的完整开放阅读框(ORF)。根据该基因推导出447个氨基酸序列,理论分子量约为50KD,等电点为4.68,该序列含有2个氨基酸保守区:NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE,并且在该基因的5’端启动子调控区发现TATA-box保守基因序列。系统发育关系研究表明:本研究扩增出的基因与其它昆虫β-tubulin基因序列有较高的同源性,达90%左右。     

柑桔黄龙病病原DNA片段的克隆及序列分析

 本研究利用聚合酶链式反应技术(PCR),合成了中国柑桔黄龙病病原的一段DNA片段。将此片段插入到pUC18的EcoRI位点,并转化进大肠杆菌(Escherichia coli)的DH5α菌株中。通过PCR鉴定,限制性内切酶(EcoRI)酶切分析及核苷酸序列分析,均表明克隆成功。序列分析结果显示,克隆片段与已知相应序列间同源性达98.6%。该研究为制备柑桔黄龙病病原DNA分子探针奠定了基础。     

烟草花叶病毒及其弱毒株基因组的cDNA克隆和序列分析

 利用RT-PCR技术获得了覆盖整个烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)强毒株TMV-W、2个弱毒株TMV-017和TMV-152基因组(RNA)的cDNA克隆。序列测定结果表明,强、弱毒株全长均为6 395个核苷酸,具有4个开放阅读框(open readingframe,ORF),分别编码126、183、30、17.6 kDa蛋白。TMV-W和普通株系TMV-U1的基因组同源率达到98%,TMV-W为普通株系。TMV-017、TMV-152基因组发生变异的部位主要在126/183 kDa ORF中。和TMV-W相比,TMV-017仅在126 kDa蛋白ORF中有18个碱基发生变异,其中10个碱基引起氨基酸的改变;而TMV-152在183 kDa ORF中有16个碱基发生变异,其中有11个引起氨基酸的改变。TMV-017和TMV-152有11个共同变异的碱基,其中有8个引起氨基酸的变异。TMV-152在30 kDa ORF中有1个碱基发生变异而引起氨基酸的改变。其它区域,三者完全相同。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

几丁质脱乙酰基酶(CDA)在昆虫几丁质代谢中具有重要作用.本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列.该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku.克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区(47～103),催化区(199～355),低密度脂蛋白受体区(124～158).序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异.苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA(GQ411189)一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA(AY966402)、蓓带夜蛾CDA(EU660852)和棉铃虫CDA(GQ411190\GQ411191\EF600051)氨基酸序列间的一致性只有36%～38%,属于两类CDA类群中的一类.基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU1188855.     

亚洲玉米螟幼虫体内储存蛋白cDNA片段克隆与序列分析

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guen e)幼虫体内储存蛋白(SP)表达调控的分子机制,根据不同昆虫储存蛋白基因序列的保守区域,设计合成简并引物,采用RT-PCR技术从亚洲玉米螟5龄幼虫中扩增出一段cDNA片段,大小为892bp,编码297个氨基酸,预测分子量为35.7kD,理论等电点pI值为8.73。该基因序列中含有保守的幼虫储存蛋白(LSP)两个特征基序YFTEDIDLNTYYYYFHVDYP和TALRDPVFC。Blast P分析结果表明:该片段推导的氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura适量甲硫氨酸SP-1的一致性最高,为77%;与小菜蛾Plutella xylostella富含甲硫氨酸SP-1和SP-2、印度谷螟Plodia interpunctellaSP、美国白蛾Hyphantria cuneaSP-2和粉茎螟Sesamia nonagrioides适量甲硫氨酸SP氨基酸序列的一致性分别为74%、74%、72%、71%和65%。构建系统发育树分析了9种鳞翅目昆虫储存蛋白进化关系,结果显示:亚洲玉米螟cDNA片段氨基酸序列与小菜蛾富含甲硫氨酸SP-1的亲缘关系最近,与粉茎螟适量甲硫氨酸SP亲缘关系最远。     

玉米黑粉菌cyp51基因上游调控区克隆及生物信息学分析

为探明玉米黑粉菌cyp51基因的表达调控机制,根据玉米黑粉菌cyp51基因cDNA的5'-序列,采用染色体步移技术,获得其5'-上游调控区序列,总长为490bp.利用NNPP分析软件预测转录起始位点,并采用TFSEARCH 1.3软件分析转录因子结合位点.结果显示:转录起始位点位于上游134bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(分别位于-30、-58、-318和-348 bp处)和CAAT盒(分别位于-150、-161和-191 bp处),亦包含多个转录因子结合位点,如AP-4、GATA-1、CdxA、Dfd和Oct-1等;在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从-222 bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSE).     

Cloning of a sodium channel gene and identification of mutations putatively associated with fenpropathrin resistance in Tetranychus urticae

Tetranychus urticae Koch is the most serious mite pest to various orchard trees and garden plants. Biochemical and molecular analyses were conducted to elucidate resistance mechanisms in a fenpropathrin-resistant mite strain (FenR). No significant differences were found in the activities of carboxylesterase and glutathione-S-transferase between the susceptible (UD and PyriF) and FenR strains. Cytochrome P450 activity was highest in PyriF, followed by FenR and UD. Analysis of detoxification enzyme assays, therefore, suggested that metabolic detoxification plays little role, if any, in fenpropathrin resistance. However, the FenR strain showed approximately 104- and 33.3-fold slower knockdown responses than UD and PyriF strains, respectively, suggestive of sodium channel insensitivity as a major resistance mechanism. We cloned cDNA fragments of the para-homologous sodium channel α-subunit gene (Tuvssc) and determined its full-length nucleotide sequences. The complete open reading frame of Tuvssc was 6627 nucleotides, encoding 2209 amino acids. The amino acid sequences of Tuvssc were 47.5% and 51.2% identical to the fruit fly and varroa mite, respectively. Amino acid sequence comparison between the three strains revealed two mutations (L1022V and A1376D) and one deletion (HisDel^1278-1280) found only in FenR mites, among which the L1022V mutation was proposed to play a major role in knockdown resistance to fenpropathrin.     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。     

爪哇根结线虫-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长克隆和序列分析

 以爪哇根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3'末端和5'末端的RACE,获得-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长。此cDNA全长序列为1 675 bp,包括1 521 bp的完整ORF,编码一含506 aa的多肽。该基因命名为Mj-eng3-,其推导蛋白的编码氨基酸与南方根结线虫的-β1,4-内切葡聚糖酶基因MI-ENG-1、MI-ENG-3和MI-ENG-4的同源性为95.3%、95.8%和85.3%,与另外5个植物寄生线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因推导蛋白PP-ENG-1、GR-ENG-1、GT-ENG-1、HG-ENG-1、HS-ENG-1编码氨基酸的同源性分别为51.2%、43.7%、43.7%、46.8%和45.3%。     

紫茎泽兰CYP75基因cDNA片段的克隆与鉴定

根据菊科植物P450基因CYP75 B5(GenEMBL AF313489)和C YP75 B6(GenEMBL AF313488)核酸序列同源区设计引物,用RT-PCR方法从紫茎泽兰植株中获得一大小为378bp的细胞色素P450基因片段。经克隆、测序及氨基酸序列同源性比较,发现由该片段推导出的氨基酸序列与C YP75 B5和C YP75 B6的氨基酸序列分别具有79.5%和85.6%的同源性,与C YP76 B1、C YP81 B1 v1、C YP81 E1 v2同源性分别为40.8%、35.2%、35.0%,与C YP73 A家族的同源性在28.9%～31.4%;所绘制的系谱树与同源性分析结果一致。因此,初步确定该序列为C YP75家族中某一成员的结构基因片段。     

中华卵索线虫tra-1基因cDNA片段的克隆及实时定量表达分析

差异(P>0.05).线虫在宿主体内不同的感染强度(40/1与10/1)对tra-1基因转录活性无显著影响(P>0.05).表明tra-1基因参与调控中华卵索线虫雌性生殖系统的发育、卵的形成以及胚胎的发育.     

First molecular genotyping of voltage gated sodium channel alleles in Culex quinquefasciatus populations in Malaysia

A nationwide investigation was performed to detect the presence of 1014 mutation(s) in voltage gated sodium channel (kdr) gene of Culex quinquefasciatus from 14 residential areas across 13 states and a federal territory in Malaysia. Molecular genotyping of kdr mutation was performed via a modified three tubes allele-specific-polymerase chain reaction (AS-PCR) and direct sequencing of kdr gene. Based on the results of AS-PCR, homozygous susceptible (SS) genotype was found in nine out of 14 populations with 38 individuals from a total sample size of 140. Heterozygous (RS) genotype was most predominant (99 individuals) and distributed across all study sites. Homozygous resistance (RR) genotype was detected in Perak (one individual) and Selangor (two individuals). The resistance kdr allele frequencies ranged from 0.1 to 0.55, with the highest being detected in Cx. quinquefasciatus population from Selangor. This study has documented the first field-evolved instance of 1014F mutation in Malaysian mosquitoes and the findings of this study could be utilized in the implementation of strategic measures in vector control programs in Malaysia.