根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

农杆菌介导蝴蝶兰的遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导法,将ACC合成酶反义基因导入蝴蝶兰原球茎中,比较不同PPT筛选压力、Mer浓度和侵染时间等对蝴蝶兰转化的影响,优化蝴蝶兰的遗传转化体系.结果表明,在OD600值为0.2～0.3的农杆菌菌液中侵染120 min后,放入含有20mg· L-1Mer和2.0 mg·L-PPT的筛选培养基中的原球茎,遗传转化效率最高.     

农杆菌介导的唐菖蒲遗传转化体系的建立

在唐菖蒲‘Advanced Red’胚性愈伤组织受体系统的基础上,建立其遗传转化体系。采用根癌农杆菌(GV3101)介导法,研究了侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、负压和筛选方式等因子对唐菖蒲遗传转化效率的影响。结果表明:在遗传转化过程中,不经预培养,负压处理下,农杆菌菌液OD₆₀₀为0.6~0.8,侵染时间15~20 min,添加100 μmol/L AS,共培养3 d,可获得较高的遗传转化效率。经过3~4个月选择培养,部分抗性植株经PCR和Southern杂交检测表明,目的基因gus已整合到唐菖蒲基因组中。     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

超声波辅助农杆菌介导法转化鱼腥草的初步研究

应用超声波直接转化法、农杆菌介导转化法、恒定频率的超声波仪处理植物15 min后再用农杆菌介导法侵染植物和在农杆菌侵染过程中辅助以超声波处理10 s 4种方法对鱼腥草进行转基因研究,结果显示:上述4种转化法对gus基因最大瞬时表达率依次为47%、60%、80%和75%。结论:用恒定频率的超声波仪处理植物15 min后再用农杆菌介导法侵染植物和在农杆菌侵染过程中辅助以超声波处理10 s两种转化法gus基因的瞬时表达率最高,说明超声波辅助农杆菌介导遗传转化方法是一种高效的鱼腥草转基因方法,它实现了外源基因在植物中的高效表达。     

超声波辅助对农杆菌介导“美人指”葡萄遗传转化中GUS瞬时表达的影响

通过超声波辅助农杆菌介导法,优化"美人指"葡萄遗传转化体系。利用GUS瞬时表达的方法研究了不同功率、时间条件下的超声波处理,外植体类型以及AS浓度对"美人指"葡萄遗传转化效率的影响。结果表明:外植体茎段在含75mg/L AS农杆菌悬浮液中侵染4 min,并在此期间,用功率为90 W的超声波处理14 s,获得最佳GUS瞬时表达率42.8%。     

基于农杆菌介导的小麦遗传转化体系的影响因素的分析

对用农杆菌介导法进行小麦的遗传转化中,小麦的基因型、外植体种类、农杆菌侵染条件、添加酚类化合物、表面活性剂、超声波和抽真空几个重要影响因素进行了分析,为建立小麦高效遗传转化体系奠定了基础。     

矮牵牛‘梅林’遗传转化体系的建立

在矮牵牛‘梅林’再生体系基础上,建立根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系,以获得转PSARK-IPT基因的矮牵牛植株。结果表明,转化效率最高的预培养时间为2d,农杆菌侵染浓度为OD600=0.5,侵染时间为3min;共培养时间为36h;适宜的抑菌抗生素头孢霉素浓度为500mg·L~(-1);潮霉素作为遗传转化中的筛选标记,选择2mg·L~(-1)为叶片分化筛选压,4mg·L~(-1)的Hey为最佳生根筛选压。对获得的15株潮霉素抗性植株进行PCR及RT-PCR检测,证明7株为阳性,证实目的基因已整合到这7株矮牵牛基因组中。     

天山雪莲遗传转化体系建立

采用根癌农杆菌介导法进行GFP基因的遗传转化,建立了农杆菌介导天山雪莲遗传转化体系。以天山雪莲胚性愈伤组织为受体;40 mg/L的卡那霉素为胚性愈伤组织筛选质量浓度;胚性愈伤组织预培养2 d后用含100μmol/L AS和500 mg/L脯氨酸的感染工程菌液侵染25 min,能够取得比较理想的转化效果。对8株卡那霉素抗性植株进行PCR及GFP荧光蛋白检测,共获得6株阳性植株。结果表明GFP基因已整合到天山雪莲的基因组中并得到表达。     

基因枪轰击法将蜘蛛丝蛋白基因(ADF3)转入海岛棉的研究

用海岛棉茎尖作为基因枪转化的靶材料,建立了可重复的海岛棉转化系统.将海岛棉茎尖分生组织经过3～6周的诱导、继代培养生长后,可以形成足够量的再生植株.用含有Npt-Ⅱ基因和蜘蛛丝蛋白基因的质粒轰击新疆海岛棉4个品种茎尖分生组织,在含有70～100mg/l卡那霉素的培养基上筛选、预再生、再生及生根培养,获得的24株抗卡那霉素转基因再生植株.所获得的转基因植株经卡那霉素筛选,再生植株总DNA提取,Southern点杂交分子检测,初步证明有2株转化植株目的基因已整合到海岛棉基因组中,同时也已得到种子.研究为通过植物基因工程的方法以期改良棉花纤维品质提供了一条新的途径.     

秋水仙素对蝴蝶兰试管苗叶切片胚状体发生期的化学诱变

 【目的】以蝴蝶兰试管苗叶片为材料诱导多倍体。【方法】用不同浓度的秋水仙素,对蝴蝶兰试管苗离体叶片进行诱变处理,考察不同处理时间类原球茎形成及苗再生的效应,比较二倍体和多倍体试管苗的形态特征、叶片下表皮组织细胞结构特征,并对多倍体根尖细胞染色体数进行鉴定。【结论】秋水仙素对蝴蝶兰离体叶片类原球茎的形成及其再生苗产生较大影响,较高浓度的秋水仙素处理时间较长,形成类原球茎的叶片比率及再生苗数减少明显,但多倍体形成的比率相对较高。多倍体苗叶片表面粗糙、叶片厚实、植株较矮,生根数少而粗短。叶片下表皮组织细胞、气孔结构与二倍体差异大,细胞核明显较大,染色体加倍。     

蝴蝶兰类原球茎液体培养中用秋水仙素诱导多倍体

采用0.05%、0.10%和0.20%3种浓度的秋水仙素分别对液体培养过程中的蝴蝶兰类原球茎进行1、3和7 d的诱变处理,考察各处理蝴蝶兰类原球茎的生长状态、组织学特征及其分化成苗的状况,并对多倍体进行鉴定。结果表明:不同浓度秋水仙素对蝴蝶兰类原球茎的生长状况均产生一定影响,类原球茎相对膨大,表面粗糙,呈暗绿色,浓度越大、处理时间越长,影响越明显;不同浓度秋水仙素诱变时间长短与类原球茎细胞内部结构发生变化的程度关系密切;秋水仙素处理后的类原球茎分化苗周期增长,成苗率降低;不同处理的多倍体诱导频率不同,最高诱变率可达30.0%;多倍体在形态、细胞组织学上与二倍体差异明显,细胞核变大,染色体数目加倍。     

微针注射甜玉米胚芽gus基因转化瞬时表达研究

[目的]研究微针注射甜玉米（Zea mays L.）胚芽gus基因转化瞬时表达,为玉米遗传转化的进一步研究奠定基础。[方法]以农杆菌为介导,采用gus基因瞬时表达技术,建立了胚芽注射开放性基因转化体系。[结果]3 mm长的胚芽为最适转化受体;农杆菌EHA105菌液浓度最适OD值为0.558～0.630;gus基因转化最适共培养天数为3 d。在以上最适转化条件下,微针注射胚芽生长点基因转化率为1%。[结论]该研究可为改良甜玉米遗传性状,培育基因工程新品种提供参考。     

超声波法直接导入外源基因：高效烟草转化系统的建立

 报告了一种新的将外源基因导入带壁植物细胞的方法——超声波直接导入外源基因法。将烟草叶片小块置于含pBI121.1质粒的缓冲液中，用声强为0.5w/cm#+2的脉冲超声波处理30分钟，培养一天后86%的叶块中检测到有GUS基因的短暂表达，叶片组织的平均转化面积高达60%-70%。处理叶块中的60%在含Kan 100mg/1的分化培养基上再生出Kan抗性芽，对照叶块则在此培养基上全部死亡。经检测Kan抗性小植株叶片中的GUS活性，按外植体总数计算，稳定转化率达22.3%，抽样检测NPTII活性和DNA斑点杂交均显阳性，证明外源基因已整合到烟草DNA中。     

超声波辅助农杆菌介导转化大豆未成熟胚的研究

[目的]进一步提高栽培大豆的遗传转化效率。[方法]以吉林省大豆主栽品种吉育67、吉育89未成熟子叶为外植体,对超声辅助农杆菌介导大豆遗传转化过程中处理液浓度、超声强度和时间等参数进行了优化。[结果]在农杆菌菌液浓度OD600为0.4,超声功率中,转化率约为4.35%。[结论]为进一步开展以大豆未成熟子叶为外植体的高效遗传转化及相关应用研究提供了参考。     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

番红花组织基因枪转化瞬时表达检测

用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入经济植物番红花的叶鞘和叶、芽来源的愈伤组织块中 ,4 8h后染色检测到了gus基因的瞬间表达 ,2 0d后仍检测到极少量表达 .研究发现 ,轰击前在加有 0 5mol L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理 6h ,明显增加了gus基因表达的数量 ;选择 110 0psi× 9cm的轰击条件 ,转化效果最好 ;高浓度卡那霉素 (5 0 0～ 80 0mg L)可以作为筛选剂 .结果表明 ,基因枪法是有效的番红花遗传转化方法 ,gus基因可以作为番红花基因工程研究的报告基因 ,CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在番红花组织中表达     

以基因枪法转化日本结缕草获得转基因植株

将含有DREB1A和gus基因的双基因载体质粒包裹在金粉上,以基因枪轰击日本结缕草胚性愈伤组织,以gus基因的瞬时表达研究日本结缕草基因枪转化参数.结果表明, 在1 100 psi压力下6 cm的轰击距离、每皿轰击2次的转化效果最好,而金粉和质粒用量对转化效率影响不显著;经过筛选和再生培养,检测到gus基因的稳定表达,并获得日本结缕草潮霉素抗性株系,PCR-Southern杂交证实外源DREB1A基因已整合到日本结缕草基因组中.