肉色吸水链霉菌SH121接合转移系统的建立

利用单因素试验探索了热激处理、预萌发时间、供体宿主菌的类型、供受比及MgCl_2浓度对链霉菌SH121接合转移效率的影响,结果显示:在50℃热激10min,37℃预萌发1h,以大肠杆菌DCDA/pUZ8002为供体宿主菌,在供受比为100∶1时,使用添加40mmol/L MgCl_2的培养基M-ISP4,接合转移效率最高可达到每受体1.03×10~(-3)个接合子。利用建立好的接合转移方法,将整合型质粒pSET152和基因敲除质粒pYZ09成功地导入链霉菌SH121,证实该方法可用于后期链霉菌SH121活性天然产物的挖掘及其相关生物合成基因簇的研究工作。     

雷帕霉素产生菌吸水链霉菌NRRL5491接合转移系统的建立

对标准的链霉菌接合转移方法进行优化建立起适用于吸水链霉菌NRRL5491的接合转移系统。40℃温浴20 min为孢子的最佳热激处理条件;整合型质粒pSET152的接合转移效率是穿梭型质粒pOJ446的3~6倍;当阿泊拉霉素覆盖浓度为1μg/mL时,pSET152的接合转移效率是50μg/mL时的4.6倍,而pOJ446接合转移效率相应提高了2.4倍;MS培养基上接合转移效率是SY琼脂培养基上的3.4倍。采用最适优化条件时,接合转移频率可达到2×10-6,足够用于基因置换等遗传操作。     

固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021接合转移系统的建立及优化

[目的]建立和优化固氮链霉菌Streptomyceschartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术.[方法]以大肠杆菌Escherichiacoli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌,进行菌株WZS021接合转移.[结果]选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基,50℃热激10 min,供受比为1:10,涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素,添加MgCl2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高,达3.24×10-6.[结论]通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系,有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作.     

金色链霉菌接合转移体系的构建

以金色链霉菌J13基因组DNA为模板,扩增金霉素C6甲基化酶基因ctcF上下游序列作为两端同源交换臂,在两臂之间添加抗性筛选标记neo基因,并在该基因上游加入组成型强启动子ermE*,以强化筛选标记.将该外源DNA序列插入到质粒pSET152,构建重组质粒pFD106.转化大肠杆菌ET12567后,经接合转移导入金色链...     

密旋链霉菌Act12遗传转化系统的建立与优化

密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12是分离自黄土高原的1株多效放线菌,具有良好的生防应用价值,为了深入研究与利用,需建立该菌株的高效遗传转化系统。本试验以整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌S17-1为供体,Act12的孢子为受体时,在改良2CMY培养基上进行接合转移,孢子预萌发条件为50℃热激10min,阿普霉素质量浓度为10.0mg/L,覆盖时间为18h,转化效率达到2.079×10~(-5)。以抗阿普霉素基因为目的基因,通过PCR验证,成功地将质粒pSET152转入到Act12中。同时,利用该转化系统,成功敲出Act12基因组中一可能的负调控转录因子spa0520,并获得了次级代谢图谱明显变化的缺失突变株Δspa0520。所构建的Act12遗传转化系统,为后续对其生防活性机理的研究以及深入开发利用奠定了基础。另外,通过培养基的改良发现,Act12在氮源含有NO-3时产孢丰富,为后续研究提供了思路。     

加纳链霉菌接合转移体系的建立与优化

加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)是动物饲料添加剂黄霉素的主要生产菌。建立高效稳定的遗传操作系统是对该菌进行分子生物学研究和构建高产黄霉素基因工程菌的基础。以含有基因整合型重组质粒pIJ8630-nsdA的Escherichia coli ET12567/pUZ8002为供体、加纳链霉菌ATCC 14672为受体进行接合转移,通过单因素试验与正交试验对接合转移过程中的关键影响因素进行优化。结果表明,WL50培养基为接合转移最适培养基,当受体加纳链霉菌ATCC 14672孢子在50 ℃条件下热激10 min、37 ℃预培养3 h后,与供体按细胞数比例1∶15混合后涂布于接合转移平板上,30 ℃培养14 h后覆盖50 μg·mL^-1安普霉素和500 μg·mL^-1萘啶酸时,接合频率最高,比优化前提高20.3倍。     

黄色链霉菌TRM45540遗传转化系统的构建

黄色链霉菌(Streptomyces luteus)TRM45540是分离自新疆罗布泊土壤的高产放线菌素D的链霉菌新物种,为了深入挖掘其基因功能和代谢活性,需要建立该菌株的遗传转化系统.本研究以整合型载体pSET152和自杀型载体pKC1139为出发质粒,ET12567(pUZ8002)为供体菌,TRM45540为受体...     

玫瑰孢链霉菌SWU2010遗传转化体系的建立和优化

玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)是近几年备受关注的抗生素—达托霉素(Daptomycin)的产生菌, 具有重要的研究价值和应用前景.目的:为了对Streptomycesroseosporus中的功能基因进行研究,构建达托霉素 高产菌株,需要建立一种稳定、高效的遗传转化体系.方法:以 pSET152和 pKC1139为载体,探索优化了S.roseosporusSWU2010与大肠杆菌进行接合转移的条件,以此为基础将体外构建的ploxP质粒和带有cre重组酶基因 的质粒pALcre先后转入S.roseosporusSWU2010中.结果:AS-1培养基是接合转移的最佳培养基;孢子的预萌发 条件为50℃热激10min,转化效率达10-6~10-5.另外,抗生素覆盖时间16~18h效果最好.利用已建立的接合 转移体系,成功将两侧带有loxP位点的安普霉素抗性基因成功敲除.实验结果为进一步研究达托霉素的生物合成 基因和对达托霉素进行组合生物合成改造奠定了基础.     

生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。     

生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化*

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S.scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌.该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuziginea Poll.)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有良好的生防应用潜力.为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能基因进行研究,得到高产抗生素的工程菌株,首先应对该菌的遗传转化条件进行优化.作者分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质pKC1139为出发质粒,ET12567(PUZ8002,pSET152/pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基、燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验.结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了Men-myco-93-63中.以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,转化效率是10-7～10-6.以菌丝体为受体时,转化效率是10-7～10-6,但菌丝培养过程中容易出现污染.另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16～18 h覆盖效果最好.     

不吸水链霉菌辽宁变种基因转移系统的建立

以嘧肽霉素生物合成阻断突变株UV2136为研究对象,建立了不吸水链霉菌辽宁变种的基因转移系统.UV2136对硫链丝菌素高度敏感,选择含有该抗生素标记的质粒pU702和pWHM3,探索其转化UV2136的可能性.结果表明:UV2136含有较强的限制修饰系统,采取热衰减法获得原生质体、原生质体热处理、冷处理、EDTA处理、质粒DNA变性等,均不能实现质粒pH702向UV2136的转化.来自非甲基化宿主E.coli ET12567的pWHM3也无法实现转化,而源于E.coli DH5α的甲基化pWHM3.可以低频转化菌株UV2136,转化效率分别为4转化子·μg-1 pWHM3,经自身修饰的pWHM3可实现高效转化,达到104转化子·μg-1pWHM3.     

农村土地流转制度建设探讨

农村土地流转制度建设的重点是建立健全土地流转机制和流转市场。农村土地流转应选择计划调控与市场调节相结合的运行机制；应建立和培育包括土地所有权市场、土地使用权出让市场和土地使用权转让市场在内的完整土地流转市场体系；农村土地流转制度建设必须有相应的配套保障体系     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

阿维链霉菌双组分信号系统的生物信息学分析

应用多种生物信息学方法,如序列比对、多序列比对、系统进化树分析、二级结构预测等,对阿维链霉菌中双组分信号系统蛋白进行鉴定分析。结果表明:阿维链霉菌中存在61个组氨酸蛋白激酶,其中30个组氨酸蛋白激酶包含了全部的保守传递器结构域。阿维链霉菌中也存在69个应答调控蛋白,主要分布在3种主要的应答调控蛋白家族中。与天蓝色链霉菌和其他微生物中双组分信号系统进行比较和对功能结构域进行分析,表明:在这些蛋白所组成48个双组分信号系统中,多个双信号调控系统与阿维链霉菌中环境刺激反应和调控相关。     

一株产黑色素链霉菌的分类鉴定

菌株S3是从厦门石胄头近海海水中分离到的,不产生抗菌活性物质,而产黑色素的一株放线菌.在其形态、培养及生理生化特征、细胞壁组分测定等传统的分类学方法的基础上测定和分析了菌株的16S rDNA序列.结果表明,菌株S3在多种培养基上产黑色素,孢子椭圆或圆柱状,在ISP培养基上培养特征与Streptomyces Puniciscabiei基本一致,菌株S3的16S rDNA序列与S.Puniciscabiei的同源性为99.595％,鉴定其为S.Puniciscabiei.     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

不吸水链霉菌公主岭新变种对大豆生长和产量的影响

[目的]明确农抗769作为免疫诱抗剂在大豆不同生育期和生长环境下对其产生的影响。[方法]以农用生防菌不吸水链霉菌公主岭新变种(农抗769)为试验材料,采用盆栽、田间种植等方法研究了该链霉菌对大豆生长的促生作用。[结果]不同品种的大豆对农抗769菌液的敏感性不同,其中农抗769菌液浇灌处理的大豆出苗率可提高1.2%~16.9%。不同生育期和种植环境大豆株高、茎粗、叶面积及根系等生长势指标的变化略有不同,各项指标的增长最多分别可达19.63%、37.35%、23.22%和19.92%,不吸水链霉菌公主岭新变种菌液对大豆生长的促生效果明显。菌液浇灌可提高大豆产量,其贡献在于促进大豆结荚数的增加。[结论]农抗769菌液对大豆出苗、生长及产量均具有促进作用。