百合MDHAR基因的克隆与表达分析

抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)作为植物细胞内重要的自由基清除剂,是通过参与一系列的氧化还原反应而发挥抗氧化剂的功能.单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中,可以将氧化型抗坏血酸(MDHA)还原为还原型抗坏血酸(AsA),在维持植物体内抗坏血酸的正常代谢和植物体氧化还原平衡方面起着重要作用(Chen et al.,2003;2005).     

新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达

杨树受损伤后能诱导一些基因的表达,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用.用PCR方法从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1.序列分析表明:此基因不含内含子,其翻译起点上游具有'TATA'和 'CCAAT'等转录控制元件,包含的阅读框架能编码一个长为213个氨基酸的多肽.此多肽与克隆自美洲山杨的PtTI2 和PtTI1氨基酸序列同源性最高,分别为95%和80%,其N端存在一长度为27个氨基酸的信号肽.将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5 μg融合蛋白可完全抑制1 μg牛胰蛋白酶的活性.Western blot分析表明融合蛋白与PtTI2特异的抗体之间有明显的血清学反应.     

刺五加过氧化氢酶基因的克隆与表达分析

为了深入了解过氧化氢酶(catalase,CAT)基因在刺五加抗逆反应及次生代谢中的作用,采用RACE技术克隆到刺五加CAT基因的cDNA全长序列,并通过RT-PCR法检测了CAT在刺五加不同生长发育时期和器官中的表达情况。刺五加CAT基因cDNA全长1 840 bp,开放阅读框长1 479 bp,编码492个氨基酸的蛋白。该蛋白包含CAT家族的标志性序列,定位于过氧化物酶体。刺五加CAT基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。其中盛花期的表达量最高,是最低量果实基本成熟期的1.28倍;各器官中,叶柄的表达量最高,是茎最低量的1.48倍。     

蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130).Cpchia cDNA全长为1 184 bp,开放阅读框为954 bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为Class Ⅰ b型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族.将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200 U·mL~(-1).酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH 7.0有利于酶的稳定和活性发挥,40 ℃活性最高,在0 ℃低温下也有较高活性.上述结果说明,分离的Cpchia基因编码蛋白具有几丁质酶活性,而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关.     

光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2 128 bp,开放阅读框(ORF)为1 830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表...     

油茶钙调素基因的cDNA克隆与表达分析

在构建油茶近成熟种子cDNA文库的基础上,分离鉴定了油茶钙调素基因CoCaM1、CoCaM2的cDNA序列(Gen Bank登录号:EU856536和FJ649316),它们的长度分别为953 bp和1024 bp,均含有447 bp的开放读码框,编码的149个氨基酸完全相同;它们编码区的核苷酸序列高度一致,仅有25个碱基替代,证实了"多个基因编码一种蛋白"的假设。该蛋白含有19种氨基酸,属于酸性亲水性蛋白,理论等电点4.10,相对分子量16.83 kDa;它含有EF-手臂、半胱氨酸等结构域。该蛋白的亲水性/疏水性、柔性、抗原性具有较好的一致性,并表现高度的柔性。Blast及遗传进化分析表明:该蛋白的氨基酸序列与其它植物钙调蛋白的氨酸序列同源性较高。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表达量较高;而CoCaM2在果实形成、膨大、油脂积累过程中的表达量较多,而在叶片和成熟种子中较少。这表明它们在花芽发育、果实形成、种子油脂合成积累中发挥着不同的调控作用。     

羊肚菌液体培养基的筛选

以5种不同的液体培养基配方(Y1:麦麸、黄豆粉;Y2:马铃薯、黄豆粉;Y3:马铃薯、酵母膏;Y4:麦麸、酵母膏;Y5:米糠、黄豆粉)对羊肚菌进行液体培养,结果表明:Y4培养基中菌球大小均匀、个数多为95个(100mL)~(-1),菌丝生物量最大,为10.24g L~(-1),菌丝粗多糖得率最高,为11.45%。在5种培养基中,麦麸、酵母膏培养基为最佳培养基。     

梁山慈竹BABY BOOM基因的克隆与表达分析

以梁山慈竹Dendrocalamus farinosus转录组数据库为基础,采用同源克隆技术从梁山慈竹笋中克隆到1个BABY BOOM(BBM)基因,命名为Df BBM,其开放阅读框长度为1101 bp,推测编码366个氨基酸残基。蛋白功能域预测分析表明,Df BBM基因含有AP2结构域,证明该基因确实属于AP2/ERF转录因子家族基因之一;进化树分析发现,Df BBM基因与玉米的BBM2以及山羊草和旱麦草的BBM基因在一个分支上,序列高度相似;保守结构域分析发现,Df BBM和Zm BBM2,Ae BBM1,Et BBM之间含有8个保守基序,这可能有助于研究Df BBM和其他物种BBM基因的相似功能。Df BBM的三级结构预测和乙烯反应性转录因子ERF096模型高度相似。组织表达分析表明,Df BBM基因在梁山慈竹展开叶和笋尖表达较高,Df BBM基因对ABA、IAA、NAA和Me JA激素处理均有响应,其中ABA、IAA和Me JA激素处理2 h后其表达量上升达到最高值,随后开始下降;而在NAA激素处理后其表达则明显下降。     

辣木组织培养与植物激素培养基筛选试验

以辣木种子为外植体组织培养并在各培养阶段添加不同浓度植物激素培养基的试验结果表明:外植体消毒以脱壳种子→84消毒液预处理→Hg Cl2消毒效果最佳,污染率10%;最好的发芽诱导培养基为Mc+6-BA 0.4 mg·L-1,发芽率达82%;继代增殖培养基为Mc+6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1,增殖倍数达5.8倍;生根培养基为1/2Mc+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1,生根率达80%。炼苗20 d移栽于河沙∶珍珠岩∶刨花(1∶1∶1)混合基质的成活率最高。     

毛竹PePGIP基因的克隆及表达分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白是一种重要的植物防御蛋白,在植物对真菌防御中发挥着重要作用。利用同源序列比对方法从毛竹(Phyllostachys edulis)全长c DNA文库中获得1个PGIP同源基因序列(FP100022),命名为Pe PGIP。该基因序列全长1370 bp,开放阅读框1008 bp,编码335个氨基酸,分子量为36.0 k Da。蛋白序列分析表明,该序列包含8个典型的亮氨酸重复序列,属于植物胞外蛋白e LRR超家族。Pe PGIP与其他禾本科植物的PGIP均具有较高的同源性,聚类分析与来自二穗短柄草和水稻的PGIP聚在较近的分支。半定量RT-PCR分析结果表明,Pe PGIP在毛竹的根、茎、叶中均表达,且根中表达量最高。构建p EASY-Pe PGIP原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得了重组蛋白,分子量约为42 k Da。本研究为深入了解Pe PGIP的基因功能奠定了基础。     

柳树SjMIPS基因的克隆及其表达分析

肌醇磷酸合成酶(MIPS)以葡萄糖-6-磷酸为合成前体,是肌醇合成过程中关键酶。MIPS生成的肌醇在耐盐植物的耐盐机制中起到渗透压调节物的作用。该研究从柳树(Salix Jiangsuensis 2345)叶片中成功克隆出MIPS基因,命名为SjMIPS。对扩增的基因进行生物信息学分析显示柳树SjMIPS基因包含1 533 bp的开放阅读框,编码1个511个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构域分析显示SjMIPS基因含有4个保守的结构域,结构域1(GWGGNNG),结构域2(LWTANTERY),结构域3(NGSPQNTFVPG)和结构域4(SYNHLGNNDG),属于典型的MIPS基因。系统进化树分析表明柳树SjMIPS基因与杨树Pt MIPS基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示柳树SjMIPS基因在171 m M Na Cl盐胁迫处理24—48 h后上调,表明柳树MIPS基因是盐胁迫诱导型基因。该研究表明柳树SjMIPS基因为盐胁迫应答基因,在参与肌醇的生物合成、调节渗透压方面起着重要作用。     

日本海棠花粉最佳离体萌发培养基筛选及萌发过程研究

为给观赏海棠杂交育种提供参考依据,采用单因素和正交试验方法,对日本海棠花粉离体萌发培养基进行了筛选,对其花粉活力展开了研究,探讨并观察了观赏海棠花粉离体萌发条件和花粉萌发过程。单因素试验结果表明:当蔗糖、硼酸、硝酸钙的处理浓度分别为10%、0.02%(其萌发率与0.04%浓度处理的无显著差异)、0.02%(其萌发率与0.01%浓度处理的无显著差异)时,日本海棠的平均花粉萌发率及花粉管长度最高值分别达到55.2%与853.11μm、54.4%与595.07μm、37.6%与713.74μm,显著高于同一试验因素下的其余各处理。正交试验结果表明:10%蔗糖+0.02%硼酸+0.04%硝酸钙的组合培养基为日本海棠离体萌发的最适培养基,以此培养基培养的日本海棠其平均花粉萌发率与花粉管长度分别达到70.1%和777.02μm,显著高于除以(10%蔗糖+0.01%硼酸+0.03%硝酸钙)组合培养基处理以外的其他组合培养基处理。在日本海棠花粉离体萌发过程中,培养第1个小时内花粉未萌发,培养2~4 h的花粉萌发率和花粉管生长速率均达到最高值,分别达23.4%/h及259.01μm/h,培养8 h后,其萌发速率趋于平稳,培养12 h后,其花粉管生长速度趋于平稳。研究结果表明,日本海棠离体萌发的最佳培养基为(10%蔗糖+0.02%硼酸+0.04%硝酸钙)组合培养基,以此组合培养基培养2~4 h其花粉萌发率与花粉管生长速率均最高。     

牡丹PsAP2基因的克隆及表达

以牡丹品种‘赵粉’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得1个牡丹APETALA2基因cDNA全长,命名为PsAP2,GenBank登录号为HM167511。序列分析结果表明:PsAP2全长2138bp,包含47bp的5'非编码区、557bp的3'非编码区和1个长度为1533bp编码510个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因属于AP2家族。序列比对和系统进化分析表明,PsAP2与葡萄的亲缘关系最近,相似性达70%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsAP2在根、茎、叶和四轮花器官中均有表达。花瓣中的表达量最高,叶片中表达量最低。     

桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析

以果叶兼用新桑品种‘嘉陵30号’的果实为材料,采用同源克隆法和抑制PCR法克隆桑树查尔酮异构酶基因(MaCHI)全序列.该基因的基因组序列全长2 402 bp,包含2 112 bp长的ORF和290 bp长的3'UTR序列,ORF由4个外显子和3个内含子组成,该基因编码219个氨基酸.预测MaCHI编码蛋白质的分子质量为23.8 ku,理论等电点为5.29.采用RT-PCR法分析MaCHI在不同组织中的表达水平,在叶片和果中的表达量较高,在根中表达量较低.构建pET-28a(+)-MaCHI原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.     

银杏叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因GbCuZnSOD的克隆与表达

利用RACE技术首次从银杏中克隆得到铜锌型超氧化物歧化酶基因(GbCuZnSOD)的cDNA序列。GbCuZnSOD的cDNA全长为783bp。基因内部含有1个长度为642bp开放阅读框,编码长度为213个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为21.95ku,等电点为6.82。三维结构预测结果显示,GbCuZnSOD含有3个转角环和8个β折叠构成桶状的活性中心。GbCuZnSOD氨基酸序列与其他植物的CuZnSOD具有很高的相似性。进化树分析结果表明GbCuZnSOD和其他物种的CuZnSOD源自于相同的祖先。信息学分析显示,得到的GbCuZnSOD属于叶绿体SOD。Southern杂交证实,GbCuZnSOD属于一个小的多基因家族。Northern杂交表明GbCuZnSOD在银杏的茎、叶和果中有表达,根中没有表达,在叶中的表达量最高。ABA和36℃高温能诱导GbCuZnSOD的转录表达,而低温和渗透压处理结果不明显。     

油桐LACS4基因的克隆与原核及真核表达

长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在油脂代谢过程中发挥着重要的作用。以油桐近成熟种子为材料,在已构建的转录组数据库基础上,克隆得到一个油桐长链酰基辅酶A合成酶基因,在此基因c DNA全长序列的基础上,成功构建了油桐LACS4基因的真核表达和原核表达载体,其中,酵母表达载体p YES2-LACS4成功转入酿酒酵母菌株INVSc1中,并进行相关生长趋势分析;在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,原核表达载体p ET30a-LACS4也成功诱导表达,并获得大约为74k Da的表观分子量的相应目的蛋白。     

华山松花粉发芽培养基的筛选

经过试验,筛选出Ⅱ、Ⅲ号培养基,使华山松花粉发芽时间提前1—2天,减少了花粉的污染,使花粉管生长正常。     

黑木耳菌种及培养基的筛选

为优化黑木耳产业化生产,进行了黑木耳菌种和培养基的筛选试验,结果表明:(1)于7种黑木耳菌种中筛选出的延明1号、延明11和蛟耳329优良菌种可以作为黑木耳产业化生产菌种;黑木耳最适的母种培养基配方为马铃薯200g,葡萄糖20g,KH_2PO_43g,MgSO_41.5g,VB110mg,琼脂20g,水1 000mL。(2)最佳的原种培养基配方为:木屑78%,麦麸20%,蔗糖1%,石灰0.5%,石膏0.5%;其次为:木屑78%,米糠21%,蔗糖0.5%,石膏0.5%。(3)最佳栽培种培养料配方为锯末86.5%,麦麸10%,豆饼粉2%,生石灰0.5%,石膏粉1%。