ABI3130xl全自动测序仪规模化测序的影响因素研究

【目的】提高利用ABI3130xl全自动测序仪对小麦与条锈菌互作的cDNA文库进行大规模测序的成功率,降低成本。【方法】将BigDye(BigDye(Teminator V3.1 Cycle Sequencing RR-100)分别稀释16,24和32倍设计测序的PCR反应体系,分析了EDTA溶液(125 mmol/L,pH 7.0)和醋酸钠溶液(3 mol/L,pH 5.2)以及不同模板类型等相关因素对测序结果的影响。【结果】BigDye稀释16倍的PCR反应体系的测序结果易出现染料峰,影响碱基正确读值;稀释32倍体系的测序结果中可用序列短,成功率低;稀释24倍体系测序结果的可用序列长且准确率高,为最佳反应体系。EDTA溶液和醋酸钠溶液可提高DNA纯化的质量,改善测序效果。以质粒DNA为模板测序较PCR产物直接测序效果好,通过控制模板质量可以提高测序成功率。【结论】利用优化体系共测得15 000条ESTs序列,其中有高读长序列13 080条,占87.2%,表明该优化体系简单有效,且可有效节约成本。     

橡胶草种植前后土壤微生物细菌多样性研究（Ⅰ）——基础分析

[目的]对开垦荒地种植橡胶草前后的土壤微生物细菌多样性进行454测序技术并对基础数据进行分析,探求利用边际土地进行战略能源作物种植的可行性.[方法]通过蛇形取样法对土壤样品采集、用试剂盒提取土壤微生物总DNA、选择细菌16SrDNA V3 ～ V1区,进行引物设计与PCR预扩增,采用454测序技术获得数据序列并优化,用R软件进行指数多样性等基础分析.[结果]样品总DNA无蛋白质和RNA污染,PCR预扩增出500 bp左右的细菌16S rDNA.454测序序列优化序列占有效序列的90％以上,在97％相似性水平下的指数多样性显示橡胶草种植后土壤细菌OTU数目较多;Shannon-Wiener曲线和稀释性曲线显示,当测序序列细菌超过15 000时曲线趋向平坦.[结论]试验测序数据可以反应样品中绝大多数微生物信息,此次取样的数量比较合理,细菌丰富度高.     

Optimization of PCR technique for detecting sugarcane ratoon stunting disease

[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S～23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7％,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测.     

甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测.     

濒危兰科植物DNA条形码鉴定体系的建立与优化

通过设计濒危兰科植物DNA条形码ITS,matK和psbA-trnH序列的通用引物并对其PCR反应体系进行优化,对16种有代表性的濒危兰科植物进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率。结果表明:ITS,matK和psbA-trnH序列引物对濒危兰科植物的扩增和测序成功率均较高,PCR反应的最佳退火温度分别为ITS 54℃,matK和psbA-trnH 50℃。在上述反应体系和条件下获得的目的条带清晰、明亮,可作为鉴别濒危兰科植物物种的DNA条形码组合。     

葡萄基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化

[目的]建立适合该地区部分葡萄品种RAPD扩增反应体系.[方法]采用阿克苏地区部分葡萄品种(系)为试材,采用改良的CTAB法提取葡萄基因组DNA,对影响葡萄RAPD反应的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行优化.[结果]其最佳反应体系为:模板DNA 100 ng,dNTPs 0.1 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.3 μmol/L,Taq酶1.5 U,反应体系总体积为20 μL.[结论]改良的CTAB法具有步骤少、费用低、效率高等特点,比较适用于葡萄基因组 DNA的提取.优化后的体系,扩增产物稳定,条带清晰,重复性好.     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的建立与条件优化

[目的]建立贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系,并对其条件进行优化.[方法]以贯叶连翘基因组DNA为模板,用L16(45)正交试验设计系统分析引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2浓度、dNTP浓度和模板DNA浓度5种因素对贯叶连翘ISSR-PCR反应扩增结果的影响.[结果]正交试验设计的方法可以用于贯叶连翘1SSR-PCR反应体系的建立,经过优化得到贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:20μISSR-PCR反应体系中含10×PCR buffer,Mg2+浓度1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度50 U/ml,DNA浓度20 ng/μl,dNTP浓度250 μmol/L,引物浓度0.75 μmol/L.[结论]试验建立的贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系重复性好、分辨率高,结果稳定可靠.     

一种快速提取丝核菌(Rhizoctonia spp.)DNA的方法

[目的]建立一套快捷、安全、有效的丝核菌菌株DNA提取方法。[方法]采用Chelex-100法提取丝核菌菌株DNA,作为5.8S r DNA-ITS序列的PCR扩增模板,评价提取的DNA质量。[结果]采用Chelex-100法提取丝核菌DNA能够在15 min之内完成,提取的DNA可以直接作为PCR扩增模板,PCR产物经电泳检测,条带整齐、清晰、明亮,产量大,符合常规测序要求,测序结果准确。[结论]该方法具有快速简便、省时省力、经济高效的特点,是一种较为理想的丝核菌基因组DNA提取方法,适用于丝核菌菌株的分类鉴定。