Amy32B启动子在水稻中的表达分析

根据已报道的在大麦糊粉层特异表达的α-淀粉酶基因Amy32B,利用序列合成技术将Amy32B启动子与红色荧光蛋白基因RFP融合在一起,构建植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种明恢86中,对转基因水稻植株中的红色荧光蛋白RFP活性进行检测。结果表明,Amy32B启动子在水稻中同样具有活性,在糊粉层背部特异表达,在整个植株中也有微弱本底表达。这表明Amy32B启动子为外源基因在转基因水稻糊粉层中高表达提供了新的工具,也为研究基因工程改良水稻提供了新的参考。     

cDNA微阵列检测萌发期水稻重要代谢基因表达模式

使用含2200条水稻表达序列标签的cDNA微阵列检测了萌发期水稻胚芽、胚轴（含糊粉层和盾片）、胚根的基因表达模式,得到1032个有效的基因表达数据。其中,在胚芽、胚根、胚轴中特异表达的基因数分别为55、106和36个。以胚轴为参比,70个基因在胚芽、胚根中均表达上调,包括延伸因子1和多个核糖体蛋白基因,这些基因与顶端生长点的细胞分化和生长有关。胚轴特异表达的基因有36个,大部分参与胚乳贮藏物质的代谢,如聚泛蛋白基因、磷酸甘油酸激酶基因等。     

稻瘟病菌MGG14093基因功能的初步研究

根据之前的基因芯片分析,发现在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,许多基因被诱导表达。MGG14093为其中一个推测为编码分泌蛋白的未知功能基因,在病菌侵染过程中该基因表达量上调2.906。利用生物信息学在线软件对该基因编码蛋白的特性进行初步分析,并通过RT-PCR扩增进一步分析该基因在稻瘟病菌侵染水稻过程中的表达动态,利用基因敲除和过量表达技术对该基因的功能进行初步研究。结果表明:该基因编码蛋白为定位于胞外的分泌蛋白,没有已知的蛋白结构域,但可能存在几处氨基酸活性位点。MGG14093基因敲除和过量表达后,对稻瘟病菌的营养生长、产孢及附着胞分化没有显著的影响,但该基因过量表达后导致病菌的致病力下降,表明该基因可能参与病菌的致病过程。本研究结果为进一步揭示MGG14093基因的生物学功能奠定了基础。     

水稻萌发期激素信号转导和谷胱甘肽代谢转录分析

【目的】利用转录组测序技术,探究水稻萌发过程中激素信号转导和细胞内部氧化还原平衡的调控机理,以期增加对萌发过程中复杂调控机制的理解,促进萌发期基因组转录调控网络的构建,并挖掘调控种子萌发的相关基因,为水稻直播稻新品种选育提供理论参考。【方法】利用萌发0、24和48 h的种子进行动态转录组测序分析,以差异倍数≥2、错误发现率≤0.05为阈值筛选差异基因,并利用Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway数据库对萌发不同阶段的差异基因进行分析注释;同时利用实时荧光定量PCR对测序结果进行验证;最后运用String蛋白互作数据库以combined_score≥0.9为阈值分析差异基因的蛋白互作网络。【结果】在种子萌发前期鉴定到8719个差异基因,而在萌发后期仅鉴定到3480个。GO和KEGG富集结果均显示与激素信号转导相关的基因主要在萌发前期被诱导,特别是生长素信号转导途径中的GH3家族基因在萌发前期均受到显著诱导;而谷胱甘肽代谢途径中的基因在萌发后期转录更为活跃,其中谷胱甘肽-S-转移酶基因富集最多。此外,两个异柠檬酸脱氢酶基因在萌发过程中被显著诱导,经蛋白互作预测发现两个异柠檬酸脱氢酶基因与GH3家族基因可能存在相互作用。【结论】在种子萌发前期,生长素信号转导途径中的GH3家族基因可能在减弱生长素信号以及降低生长素活性方面发挥着重要作用,其高表达能降低生长素对种子的休眠作用,促进萌发启动;在种子萌发后期,谷胱甘肽代谢途径中的谷胱甘肽-S-转移酶基因可能在细胞抵抗氧化胁迫中发挥主要作用;此外,在整个萌发过程中,GH3和异柠檬酸脱氢酶家族基因的相互作用可能在实现激素转导途径和谷胱甘肽代谢途径的交互串联作用、共同调控种子萌发方面具有重要意义。     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

菠萝PEPC基因家族生物信息学分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC）在C₄和景天酸代谢（CAM）光合途径吸收CO₂过程中发挥重要作用,并参与各种非光合作用过程,包括果实成熟、气孔开放、碳氮相互作用、种子形成和萌发以及调节植物对逆境胁迫的耐受性。菠萝为典型的景天酸代谢途径（CAM）植物,为了解磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在菠萝景天酸代谢途径（CAM）中的作用,本研究鉴定到3个菠萝PEPC基因,按照基因描述命名为AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4,进化树分析结果AcPEPC1和AcPEPC3为植物型PEPC（PTPCs）蛋白,序列同源性较高且基因结构、保守结构域及保守基序均一致。AcPEPC4为细菌型PEPC（BTPCs）蛋白,与AcPEPC1/AcPEPC3间的序列同源性低。组织表达分析表明AcPEPC1菠萝叶片表达量较高,而AcPEPC3和AcPEPC4在菠萝花和果实表达量较高。     

水稻茉莉素受体基因OsCOI1a的克隆与功能研究

将拟南芥茉莉素受体基因COI1在水稻中的同源基因OsCOI1a构建到植物双元表达载体pMYC2,导入拟南芥茉莉素受体突变体coi1-1中,采用Western blot检测OsCOI1a基因的蛋白表达水平,通过观察突变体花粉的活性和果荚的育性,检测OsCOI1a对coi1-1突变体的互补情况,研究OsCOI1a基因的功能。结果表明,OsCOI1a基因能够在拟南芥coi1-1突变体中正确表达,并能部分互补雄性不育的表型,表明OsCOI1a基因在水稻茉莉素信号通路中可能起茉莉素受体作用。     

水稻抗干尖线虫基因OC-XⅡ的克隆及表达研究

抗性验证试验表明籼稻大白谷抗水稻干尖线虫侵染。为进一步探究此抗性与病程相关蛋白——半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)的相关性,基于水稻基因组数据克隆籼稻大白谷Cystatin家族的OC-XII基因,分别进行OC-XII、JaponicaOC-XII和Indica-OC-XII蛋白质三维结构构建,并与水稻干尖线虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)进行分子对接以验证OC-XII基因编码蛋白对Cathepsin B的抑制功能。通过荧光定量qPCR验证OC-XII基因在线虫侵染前后的表达特性,OC-XII蛋白可以与水稻干尖线虫Cathepsin B蛋白质特异结合,线虫侵染后OC-XII基因在浸染12h~2d期间表达量持续上调,侵染3d后下调。表明OC-XII基因在大白谷抗水稻干尖线虫侵染过程中发挥功能,具有对植物寄生线虫进行生物防治的潜力,有必要对其进行深入研究。     

水稻蛋白磷酸酶ABI2基因启动子的克隆和功能分析

分离了水稻PP2C家族中的一个成员OsABI2的启动子,测序鉴定后构建其GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的方法获得水稻转基因植株。GUS蛋白组织化学染色结果表明,OsABI2启动子驱动的GUS基因在水稻根茎叶中都有表达,在根中表达量最高,叶中表达量最低,而且根部分生组织区明显高于根部其他组织。另外在萌发的芽中也有明显表达。OsABI2启动子在T1代转基因植株的诱导表达的GUS蛋白活性分析结果表明,在机械损伤、稻瘟病、干旱逆境和ABA、MeJA和SA处理条件下,OsABI2启动子驱动的GUS活性都出现了明显上调。上述研究结果说明,OsABI2很可能参与了发育,生物和非生物逆境胁迫的调控。     

水稻对不同小种稻瘟菌抗性差异表达基因的鉴定

 以同一水稻品种接种不同小种稻瘟菌，利用抑制消减杂交（SSH）技术构建水稻 稻瘟菌非亲和/亲和互作消减cDNA 文库。 经差异筛选、序列分析及RT PCR验证，共获得25个独立的差异表达cDNA克隆。根据与它们同源基因的功能推测，这些cDNA克隆可能参与了对病原菌的防卫反应、转录和蛋白合成与修饰等一些重要的生物学过程。通过RT PCR检测了差异表达基因在非亲和/亲和互作早期的表达谱，所有被检测基因在非亲和/亲和互作零点的表达水平均相同，而在接种后的其他时间点，它们的表达在互作反应中或被诱导或被抑制，说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关，肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。受不同小种病原菌侵染后，由于一些参与防卫反应的基因被诱导或被抑制的程度和持续时间的不同可能导致水稻小种特异的抗性。     

玉米花粉扩散频率及距离研究

利用紫色玉米紫糯18作为花粉供体,常规玉米吉单35作为花粉受体,通过模拟玉米花粉扩散实验,研究玉米外源基因向周围环境遗传漂流的频率和距离。结果表明,玉米花粉的扩散频率和距离与供、受体花粉的数量、花粉活力持续的时间及玉米散粉时的气象条件有直接关系。不同玉米品种花粉产量不同,紫糯18的单株花粉平均产量干重为3.251 5 g,吉单35为2.207 3 g。花粉的存活时间与空气湿度和温度有关,湿度高,气温低,花粉易存活。当基因的漂流阈值为1%时,供体与受体隔离距离应在45 m;当基因漂流阈值为0.1%时,隔离距离应为300 m。鉴于转基因玉米的特殊性,建议将0.1%作为转基因玉米基因漂流的管理阈值。     

Rice <Emphasis Type="Italic">UCL8</Emphasis>, a plantacyanin gene targeted by miR408, regulates fertility by controlling pollen tube germination and growth

Background

Pollen tube formation and growth are crucial steps that lead to seed production. Despite the importance of pollen tube growth, the molecular mechanisms implicated in its spatial and temporal control are not fully known. In this study, we found an uclacyanin gene, OsUCL8, that regulates pollen intine deposition and pollen tube growth.

Findings

The overexpression of OsUCL8 led to a striking irregularity in pollen tube growth and pollination and thus affected the seed setting rate in rice; many pollen tubes appeared to lose the ability to grow directly into the style. Conversely, plants with OsUCL8 knocked out and plants overexpressing miR408, a negative regulator of OsUCL8, had vigorous pollens with a higher germination rate. We further demonstrated that OsUCL8 mainly affects pollen intine formation. The addition of Vitamin B1 (VB1) significantly contributed to the germination of OXUCL8 pollen grains, suggesting that OsUCL8 could be associated with VB1 production. Using a yeast two-hybrid system, we revealed that OsUCL8 interacts with the protein OsPKIWI, a homolog of the Arabidopsis FNRL protein. We thus hypothesized that OsUCL8 might regulate the production of VB components by interacting with OsPKIWI. This study revealed a novel molecular mechanism of pollen tube growth regulation.

Conclusions

The rice plantacyanin family member OsUCL8 plays an important role in pollen tube formation and growth and, in turn, regulates fertility and the seed setting rate.

     

Insert copy number,chromosome number,pollen stainability,and crossability ofAgrobacterium-transformed diploid potato

Two 2n-pollen producing cultivated diploid, 2n = 24, potato genotypes DM56.4 and US-W5337.3 were inoculated with binaryAgrobacterium vectors. The T-DNA contained a neomycin phosphotransferase II coding region fused to a nopaline synthase promoter providing gene expression in plants and resistance to kanamycin. A total of 28 clones regenerated as adventitious shoots from callus tissue, growing on medium with kanamycin, was analyzed for chromosome number, pollen stainability, and crossability. Several clones were tested and found to retain crossability with diploid and tetraploid clones. Nine out of 10 of the regenerants from DM56.4 had been doubled; seven of these were tetraploids with 2n = 48, one clone had 2n = 49, and another 2n = 46. Five of 14 regenerants of US-W5337.3 had been doubled, and three of these had fewer than 2n = 48. Pollen stainability revealed that the tetraploid regenerants from DM56.4 were male sterile, whereas tetraploids from US-W5337.3 had stainable pollen. All of the diploid regénérants produced 2n pollen. Crossability of several diploid and tetraploid regenerants was high. The number of T-DNA inserts revealed by Southern blot analysis was also determined. Six, 10, and 9 regenerants had 1, 2, and 3 inserts of T-DNA, respectively. There were single regenerants each with 5, 6, or 7 inserts. Selection for higher insert number among regenerants should be feasible based on the range of insert number found. Identical restriction patterns within three groups of clones indicated that the 28 clones analyzed emerged from only 21 cells derived from independent transformation events. The variability in chromosome number and pollen stainability suggests that variation in other traits would be obtainable.     

2n pollen in eleven 2x, 2EBN wild species and their haploid x wild species hybrids

Summary Sixty-three plants producing 2n pollen were identified among 65 introductions of 11 2x, 2EBN wild species. They were found in 27 of the 65 introductions representing ten of 11 species. The gene frequencies for the allele controlling 2n pollen formation ranged from 0.19 to 0.65. Seventyeight haploid x wild species hybrid families were produced using the previously identified 2n pollen plants as male parents. One hundred and thirty-two plants that produced 2n pollen were identified among the haploid x wild species hybrids at one location and 44 at another. The high number of haploid x wild species hybrids that produced 2n pollen and the large number of hybrids with acceptable pollen stainability demonstrate the potential of the hybrids in 4x × 2x germplasm transfer. Potato breeders can unleash the genetic diversity present in the 2x, 2EBN wild species by screening them for 2n pollen and crossing the 2n pollen producing plants to haploids.     

大豆泛变应原profilin基因的克隆、序列分析和表位预测

通过生物信息学方法对多种植物性食物和花粉泛变应原proflin基因进行比对,利用其中的高度保守区域设计并合成简并引物,通过RT-PCR克隆得到一个新的大豆profilin基因(396bp,pⅠ为5.21,MW为14,1kD),序列同源性分析发现该基因和已知的多种植物性食物、花粉变应原profilin有较高的同源性(＞75%),因此认为其系大豆蛋白泛变应原profilin,命名为Gly m 3.02,EMBL/GeneBank数据库登录号为DQ784852,这为进一步重组表达和抗原表位分析等奠定了实验基础.     

转基因水稻B2花粉活力的温度模型

 以含bar基因的抗Basta转基因粳稻B2为材料,分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下进行处理,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定了不同温度处理下转基因水稻B2花粉离体0、1、2、3、4、5、6、8、12、14 min后的活力。B2花粉离体后活力呈现“S”型下降,用Logistic模型可精确模拟两者的关系; 其次, B2花粉离体后活力随着温度先升后降,花粉活力的最适温度范围是20℃~30℃,25℃时活力最强,高温对花粉活力的胁迫作用更大。采用指数方程和Logistic方程分段函数,建立B2花粉活力的温度模型,可精确预测花粉存活时间和寿命,为进一步准确估算转基因水稻基因飘移距离提供依据。     

在蒙导条件下转bar基因水稻与无芒稗间的基因漂移

以转基因水稻Y0003和99-t为父本,无芒稗为母本,在蒙导条件下研究转基因水稻与无芒稗间潜在的基因漂移可能性。用光学显微镜观察了用不同方法（紫外灯照射,反复冻融,黑暗放置）制备的蒙导花粉蒙导条件下转基因水稻花粉在无芒稗柱头上的萌发生长情况,并与无芒稗自花授粉的情况相比较。结果表明,在供试的所有蒙导花粉蒙导条件下,两种转基因水稻的花粉在无芒稗柱头上虽能萌发,但花粉管扭曲成各种形状而不能进入无芒稗柱头。与无芒稗自花授粉的花粉萌发生长有极明显的差异。杂交也不结实。说明蒙导花粉不能克服转基因水稻和无芒稗的不亲和性,转基因水稻与无芒稗间基因漂移的可能性极小。     

Development,Survival, and Reproduction of Orius insidiosus (Hemiptera: Anthocoridae) Reared on Frankliniella invasor (Thysanoptera: Thripidae)

The minute pirate bug Orius insidiosus (Say) is an important predator in mango agroecosystems. It attacks several species of thrips, particularly Frankliniella invasor Sakimura, which is considered a species of economic importance in mango. We investigated the effect of six diets on the development, survival, and reproduction of O. insidiosus: 1) first instars of F. invasor, 2) second instars, 3) adults, 4) pollen, 5) pollen plus thrips larvae, and 6) water. Individuals fed on thrips larvae, with or without pollen, completed their immature development significantly faster. Nymphs of O. insidiosus were able to complete their development feeding on pollen only, while individuals that received water as a diet were unable to reach the adult stage. The highest intrinsic growth rate was obtained when O. insidiosus were fed on pollen plus thrips larvae, and the lowest when individuals were fed on thrips adults. Our studies show that a diet of pollen plus F. invasor larvae is optimal for O. insidiosus development and population growth.     

CaCl2诱导大豆花粉管通道农杆菌转基因研究

为了提高大豆花粉管通道法转基因效率,研究直接用农杆菌转化方法的可行性,以秋大豆品种上海本地青为受体材料,用花粉管通道法在三种CaCl2浓度水平下进行质粒pCAMBIA3301转化,又以GV3101、LBA4404、EHA105三种农杆茵菌株直接导入花粉管通道为处理进行了遗传转化.以质粒为外源基因平均结实率为36.83%,T0代种子平均成活率为60.89%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为8.24%.以农杆菌直接转化平均结实率为15.92%.T0代种子平均成活率为20.40%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为7.79%.对存活的植株提取DNA进行PCR检测,以质粒为外源基因的处理共获得20株转化苗,三种CaCl2浓度水平的转化效率分别为0.56%、1.64%、1.40%,有两种水平的转化效率约为传统转化效率的三倍.以农杆菌直接转化的处理共获得5株转化苗,转化效率分剐为0.17%、0.33%、0.29 %.     

玉米花粉管伸长的时空进程

以玉米花丝为材料,采用苯胺蓝染色法检测授粉后玉米花粉管的伸长进程。授粉0.5 h后开始每隔1 h对花丝取样,直至48 h;所取花丝经固定、软化和苯胺蓝染色后压片,在倒置荧光显微镜紫外光滤片下观测花粉管伸长情况。结果表明,花粉在授粉后0.5 h就开始萌发,随后花粉管开始伸长并逐渐加速,3 h后以较高速度0.8~0.9 cm/h伸长,维持17 h后速度开始下降,22 h后大部分进入子房,整个过程中花粉管的平均伸长速度为0.68 cm/h。玉米花粉离体自然条件下的生命时间为5 h,此后开始分解。在玉米花粉介导转基因时需对离体的花粉与外源基因进行处理,这个过程消耗花粉部分内容物和能量,且影响花粉的活力,是玉米花粉介导法转化率偏低的一个重要原因。