一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

 水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒是近年来在水稻上危害日益严重的两种病毒,由于两者同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似,由此也给诊断及鉴定造成了困难。针对这一问题,通过设计简并引物,并优化体系,建立了一种快速、简便、灵敏、特异的方法,为这两种病毒的检测及鉴别提供了方便。     

湖北发生的水稻矮缩病是南方水稻黑条矮缩病毒引起的

 近年来由水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病在华南、华东等地区暴发流行,给水稻生产带来严重损失,而湖北一直未有水稻黑条矮缩病流行的报道。然而,2009年和2010年在湖北省长江沿线的荆州、孝感、咸宁、黄石、鄂州、黄冈等水稻种植区普遍发生水稻矮缩减产的现象。经过症状观察、dsRNA电泳图谱分析、RT-PCR等方法,诊断该病是由南方水稻黑条矮缩病毒引起,说明该病毒已经随介体昆虫白背飞虱从我国南方传播至中部水稻种植区。     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的致病性分析

利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体在本氏烟中分别和共同表达了南方水稻黑条矮缩病毒可能编码的6种非结构蛋白(Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91和Pns92),采用实时荧光定量PCR技术分析了其表达水平。结果表明,与PVX空载体侵染的本氏烟相比,只有Pns92蛋白的表达能够表现出典型的花叶症状,6种蛋白共同表达时的症状与Pns92单独表达呈现的症状相似。推测Pns92可能与病毒的致病性有关。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的亚细胞定位研究

病毒蛋白的亚细胞定位可以反映病毒的某种功能，是研究病毒功能的重要依据。借助农杆菌的介导，将南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV）可能编码的6种非结构蛋白分别在本氏烟细胞中表达，通过荧光共聚焦显微镜观察所表达的蛋白亚细胞定位情况。 结果表明：Pns52、Pns91定位相似，主要定位于细胞质，在细胞质中形成较大的颗粒状聚集体；Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整个细胞，主要定位于细胞质中或膜上，均形成丝网状结构；WoLF PSORT对比分析显示它们可能都是膜内在蛋白（Integral membrane protein），此外，Pns6在细胞质中还可以形成颗粒状的聚集体。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报

  研究出一种利用灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus, RBSDV）的方法。以-70℃条件下冷冻保存的RBSDV罹病植株叶片对灰飞虱饲毒,随后接种感病水稻品种,结果发现灰飞虱可从冷冻病叶上获得RBSDV,并传播RBSDV,且获毒能力和传毒能力与新鲜病叶没有差异。这表明从冷冻病叶上获得RBSDV的灰飞虱可以应用于品种抗性鉴定,此法可望加快RBSDV抗病品种的选育进程。     

水稻品种(组合)对黑条矮缩病的抗性表现

人工接种鉴定结果表明，杂交稻组合对黑条矮缩病的抗性强于常规粳糯稻品种，分析了大田生产上杂交稻黑条矮缩病发病较重的原因，提出了相应的防治方法。     

Ecological Fitness of Non-vector Planthopper Sogatella furcifera on Rice Plants Infected with Rice Black Streaked Dwarf Virus

We evaluated the effects of rice black streak dwarf virus(RBSDV)-infested rice plants on the ecological parameters and its relevant defensive and detoxification enzymes of white-backed planthopper(WBPH) in laboratory for exploring the relationship between RBSDV and the non-vector planthopper.The results showed that nymph survival rate,female adult weight and fecundity,and egg hatchability of WBPH fed on RBSDV-infested rice plants did not markedly differ from those on healthy plants,whereas the female adult longevity and egg duration significantly shortened on diseased plants.Furthermore,significantly higher activities of defensive enzymes(dismutase,catalase and peroxidase) and detoxification enzymes(acetylcholinesterase,carboxylesterase and glutathione S-transferase) were found in WBPH adults fed on infected plants.Results implied that infestation by RBSDV increased the ecological fitness of non-vector planthopper population.     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

施氮对白背飞虱在水稻上适应性的影响

 以杂交稻组合汕优63、常规粳稻品种秀水63和常规籼稻品种浙733为材料,采用室内继代饲养的方法,研究了不同类型水稻品种上施用氮肥对白背飞虱生长发育、存活率和繁殖等的影响。结果表明,施用氮肥可以显著提高白背飞虱种群生态适应性。同一水稻品种,在施用氮肥的植株上白背飞虱若虫历期缩短,随着取食代数的增加,在不施氮稻株上的若虫历期明显延长,而在施氮稻株上的若虫历期则明显缩短。白背飞虱若虫存活率随着施氮而显著提高,品种和饲养代数对其存活率也均有着极显著的影响。在施氮水稻植株上的白背飞虱雌成虫体质量和产卵量均显著高于不施氮肥上的。随着饲养代数的增加,同一品种的施氮稻株上雌成虫体质量、产卵量及卵孵化率均增加,而在不施氮稻株上则相反。水稻品种、饲养代数和氮肥水平对白背飞虱雌成虫体质量和产卵量均有着极显著的影响。     

早稻南方水稻黑条矮缩病发病率预测模型的建立与应用

南方水稻黑条矮缩病是近年来在我国南方稻区重发的一种病毒性病害。为了明确生态因子与南方水稻黑条矮缩病发病率的关系,提高预测能力,避免严重损失,笔者利用化州市2007-2015年的生态因子数据与南方水稻黑条矮缩病田间实际发生数据,采用逐步回归和通径分析的方法研究了两者之间的相关性。结果表明,上年10月下旬温雨系数和上年晚稻黑条矮缩病发病率对早稻南方水稻黑条矮缩病发病率影响最大。笔者还建立了生态因子与早稻南方水稻黑条矮缩病发病率回归模型:Y=-2.7590+0.1895 X_1+0.1345 X_2+1.0495 X~3+0.0044 X_4,利用该回归方程对历史资料进行拟合,拟合程度较好,并对2015年进行预报,预报值与实际值相差较小,准确率较高。可见,该模型适宜于化州乃至粤西地区早稻南方水稻黑条矮缩病的预测预报。     

水稻瘤矮病病毒和矮缩病病毒的核苷酸结合蛋白和核酸结合蛋白及其结合能力分析

采用α-32P标记的三磷酸核苷酸与病毒粒子共浴的方法及Northwestern分子杂交方法,研究证明了RGDV结构蛋白中,P1蛋白可能是依赖于RNA的RNA聚合酶, P5蛋白可能具有RNA鸟苷酰转移酶功能,P6蛋白可能是核酸结合蛋白,是RGDV复制包装中的关键蛋白。与RGDV结构蛋白具有相同生物功能的RDV的核酸结合蛋白与核酸的结合能力最强,依赖于RNA的RNA聚合酶与核酸的结合能力次之,RNA鸟苷酰转移酶与核酸的结合能力最弱。结果暗示了可以根据与核酸的结合能力,辅助判断RDV或RGDV这3个结构蛋白的生物功能。     

不同氮肥水平下转Bt基因水稻对褐飞虱和白背飞虱生态适应性的继代影响

在目前氮肥施用量依然偏多的大背景下,氮肥与转 Bt 基因水稻的相互作用是否会对稻田中非靶标节肢动物产生影响是转基因水稻安全评价的重要内容。本研究在室内条件下用0 kg/hm²、100 kg/hm²和250 kg/hm²3个氮肥水平处理的转 Bt 基因水稻T1C-19和T2A-1以及非转基因亲本水稻明恢63,连续饲养褐飞虱和白背飞虱4代,研究在不同氮肥条件下,转 Bt 基因水稻对褐飞虱和白背飞虱生态适应性的继代影响。结果显示,在同一水稻品种上,氮肥的过量施用,显著提高了褐飞虱和白背飞虱的生态适应性,并且随着代数的增加具有一定的累加效果。同一氮肥水平条件下,转 Bt 基因水稻和对照相比对同代褐飞虱和白背飞虱的若虫发育历期、雌虫体质量、成虫寿命、褐飞虱若虫孵化率、存活率均无显著影响。而在100 kg/hm²和250 kg/hm²施氮水平下取食转基因水稻T1C-19的褐飞虱在第1代至第3代的每雌产卵量均显著低于另一转基因品种T2A-1以及对照品种明恢63,但第4代褐飞虱在各品种上的产卵量无显著差异。本研究结果表明,氮肥的施用显著提高了褐飞虱和白背飞虱的生态适应性,供试两种转Bt基因水稻对褐飞虱和白背飞虱的生态适应性无显著影响。这为转基因水稻的安全评价提供了一定的理论依据。     

水稻广亲和品种抗白背飞虱的研究

采用苗期群体筛选鉴定法、蜜露量测定和产卵与卵孵化率测定等方法,就18个水稻广亲和品种对白背飞虱抗性表现进行了研究.筛选出5个对白背飞虱无拒取食作用和杀卵作用的水稻广亲和品种Aus371、02428、Labelle、Copslo和玉92秋14.