梅山猪与杜洛克猪中等卵泡差异表达基因的鉴定

本试验采用抑制性消减杂交技术构建了卵泡期第4天梅山猪和杜洛克猪中等卵泡M2组织差异表达的消减cDNA文库,从中筛选差异表达的基因,并通过实时荧光定量PCR对其进行验证,利用DAVID软件对差异表达的基因进行聚类分析。结果表明,从梅山猪和杜洛克猪M2卵泡消减文库中筛选得到了148和75个差异表达的ESTs,分别含有125和60个已知的基因。实时荧光定量PCR验证结果与筛选结果相符。GO功能分类注释到调控代谢、细胞循环、生物合成、胞内转运、类固醇雌激素受体和刺激等生物学过程。KEGG Pathway分析表明有6个基因参与TGF-beta信号通路,5个基因参与卵母细胞减数分裂信号通路,7个基因参与类固醇雌激素受体信号通路,推测TGF-beta信号通路中的基因可能调控猪卵泡的发育。研究结果为深入探讨卵泡发育机理和对繁殖性状影响的遗传机理奠定了基础。     

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。     

川中黑山羊和雷州山羊大小卵泡转录组学分析

试验旨在通过比较两个品种山羊大小卵泡的mRNA表达图谱来挖掘影响山羊卵泡发育的基因,为进一步阐述山羊卵泡发育机制提供数据基础。使用氯前列醇钠对川中黑山羊和雷州山羊进行同期发情处理,屠宰后采集卵巢并在体视显微镜下分离单个卵泡(大卵泡6 mm;小卵泡3 mm),提取卵泡组织总RNA进行RNA-seq,利用生物信息学方法检测mRNA表达谱,筛选差异基因,并对其进行GO功能、KEGG通路富集分析。结果显示,川中黑山羊大小卵泡差异基因共4 451个,雷州山羊2 355个,二者共有差异基因1 771个。分析筛选出两个品种共有(INHBA、INHA、CYP19A1、KITLG、LHCGR和STAR)及各自特有(IGFBP6、BMP6和BMPR2)的已报道与卵泡发育相关的基因,此外还筛选出可能与这两种山羊繁殖性能相关的基因(GADD45B、TC2N和MSMO1)。GO功能分析显示,两个品种共有差异基因主要与各种物质的跨膜转运活性有关;KEGG通路分析显示,类固醇生成、细胞因子受体相互作用和cAMP信号通路在两个品种中均存在显著变化。类固醇生成过程中细胞色素P450代谢差异可能是川中黑山羊高产仔数的一个潜在因素。本研究结果为进一步探究山羊卵泡发育的基因功能及不同山羊品种繁殖性能差异提供参考。     

miR-10b和BDNF对山羊卵巢颗粒细胞活性的影响

为研究miR-10b对山羊卵巢颗粒细胞活性的影响,从已建立的多羔(3～5只)和单羔奶山羊发情期卵巢组织差异表达的miRNAs文库中筛选出差异表达显著的miR-10b,并利用生物信息学和实时定量PCR等技术,研究miR-10b在单羔和多羔奶山羊中的相对表达水平及其靶基因表达和卵巢颗粒细胞活性。结果显示:miR-10b在单羔奶山羊卵巢组织中的相对表达量显著高于多羔奶山羊卵巢组织中的相对表达量(P0.05);miR-10b通过抑制脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达,实现对卵巢颗粒细胞活性的抑制作用。试验结果阐释了miR-10b作用于奶山羊卵巢颗粒细胞的机理,为后续研究山羊卵巢的卵泡发育提供了依据。     

川中黑山羊和雷州山羊大小卵泡转录组学分析

试验旨在通过比较两个品种山羊大小卵泡的mRNA表达图谱来挖掘影响山羊卵泡发育的基因,为进一步阐述山羊卵泡发育机制提供数据基础。使用氯前列醇钠对川中黑山羊和雷州山羊进行同期发情处理,屠宰后采集卵巢并在体视显微镜下分离单个卵泡（大卵泡>6 mm;小卵泡<3 mm）,提取卵泡组织总RNA进行RNA-seq,利用生物信息学方法检测mRNA表达谱,筛选差异基因,并对其进行GO功能、KEGG通路富集分析。结果显示,川中黑山羊大小卵泡差异基因共4 451个,雷州山羊2 355个,二者共有差异基因1 771个。分析筛选出两个品种共有（INHBA、INHA、CYP19A1、KITLG、LHCGR和STAR）及各自特有（IGFBP6、BMP6和BMPR2）的已报道与卵泡发育相关的基因,此外还筛选出可能与这两种山羊繁殖性能相关的基因（GADD45B、TC2N和MSMO1）。GO功能分析显示,两个品种共有差异基因主要与各种物质的跨膜转运活性有关;KEGG通路分析显示,类固醇生成、细胞因子受体相互作用和cAMP信号通路在两个品种中均存在显著变化。类固醇生成过程中细胞色素P450代谢差异可能是川中黑山羊高产仔数的一个潜在因素。本研究结果为进一步探究山羊卵泡发育的基因功能及不同山羊品种繁殖性能差异提供参考。     

家蚕单性生殖早期胚胎SSH文库的构建及其序列分析

为了探讨家蚕早期胚胎性别决定的分子机制,以非减数分裂孤雌生殖(AMP)和双精雄核发育(BSA)技术获得的家蚕单一性别早期(2~24 h)发育蚕卵为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了正向和反向抑制消减杂交cDNA文库。在正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机选择62个和46个克隆测序,分别获得43种和29种cDNA序列,其中25个为新的cDNA序列。生物信息学分析显示,抑制消减杂交文库中与单性生殖有关的高温、低温、辐射等诱导表达基因出现的频次较高。对部分文库序列进行半定量RT-PCR分析表明,这些基因在两种单性生殖早期发育胚胎中存在差异表达。     

鹅产蛋相关基因筛选获得成功

日前许多学者针对鹅产蛋性能普遍较低的现状,利用抑制性消减杂交技术分别构建了产蛋前期和产蛋期鹅垂体、卵巢、肝脏等组织消减cDNA文库,采用反向斑点杂交技术对文库进行了差异表达基因的筛选和鉴定,经测序获得了多个可在产蛋期鹅垂体、卵巢、肝脏组织中高效表达的基因或     

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.     

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P0.05);过表达FST显著(P0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。     

牛卵泡发育相关下调基因的筛选

为寻找牛卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡的关键调控因子,阐明单胎动物卵泡闭锁调控机理,本研究对奶牛优势卵泡与从属卵泡GCs深度测序,筛选卵泡发育相关的下调基因。选取健康荷斯坦奶牛,屠宰后,分别采集卵巢上正常发育的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8mm),并结合雌激素/孕激素确定卵泡优势与否,优势卵泡(DF):E_2/P1;从属卵泡(SF)E_2/P1。分别刮取GCs,提取总RNA并建库,Illumina测序,将获得序列与牛Refseq数据库比对后,利用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对其中表达下调的基因进行GO和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。测序共获得32 346个基因,其中194个在DF中表达显著上调,502个表达下调;GO分析结果显示,这些下调基因的生物学功能共分为3大类104组,其中生物学过程相关基因占61.5%,细胞组分有关基因占25.0%,分子功能相关基因占13.5%;KEGG信号通路分析,共发现5条通路,其中基因富集最为显著的是癌症通路;从下调基因中筛选出4个在牛卵泡发育过程中可能会起抑制作用的基因,QRT-PCR结果显示,PPP1R14A、QRFPR和EGR1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果一致,OLA1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果正好相反,但差异不显著。本研究筛选出的4个表达下调基因可能是牛卵泡发育过程中抑制卵泡发育的候选基因。