枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据枣疯病植原体16S rDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针, 以构建的重组质粒作为阳性标准品, 建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价, 制作了标准曲线。结果显示, 制作的标准曲线有极好的线性关系, 相关系数( r 2 )达到0.998, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体, 能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好, 不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测, 而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。     

喜树丛枝植原体的分子鉴定及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

 为确定在云南文山地区喜树上发生的疑似丛枝病的病原种类及快速检测喜树丛枝病,本研究利用植原体16S rDNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对感病喜树总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,通过系统进化分析,明确了喜树丛枝植原体属于16SrXXXII组。然后根据喜树丛枝病植原体16S rDNA基因保守区域设计并合成特异性引物和TaqMan探针,制备了喜树丛枝病植原体标准质粒,确定了最优引物浓度和最佳探针浓度,制作的标准曲线有极好的线性关系,决定系数(R²)达到0.999,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测喜树丛枝植原体。本研究首次明确了喜树丛枝植原体的分类地位,优化和建立了喜树丛枝植原体TaqMan探针qPCR检测方法,为快速检测喜树丛枝病植原体提供参考。     

梨衰退植原体Cycleave 实时荧光PCR检测方法的建立

 根据植原体16S rDNA 保守区设计Cycling 探针LST2probe及引物,建立了梨衰退植原体Cycleave实时荧光PCR检测方法。结果表明,探针LST2probe 能特异的检测梨衰退植原体,供试同一组内不同亚组植原体及参试病原细菌均为阴性,检测灵敏度可达0.5 pg/μL。该Cycleave实时荧光PCR检测方法可用于梨衰退植原体的快速检测,并为其他有害生物鉴定提供借鉴依据。     

玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法.该方法根据细菌16S rDNA序列的特异性,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变特异性探针,并对10种细菌菌株和5种植原体进行了实时荧光PCR.结果表明,只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光信号,而其它参考菌不产生荧光信号,检测的绝对灵敏度是14.2 fg/μl质粒DNA,比常规的PCR电泳检测高约100倍.整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无须PCR后处理.     

苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物，目前国内尚无发生6在出入境捡验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测，劳动强度大，耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突交特异性探针，利用该探针对棒形杆菌属4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号，其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强，灵敏度高，能检测到21．4fg质粒DNA，比常规PCR灵敏100倍，而且整个过程只需要2～3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速鉴定欧洲樱桃绕实蝇

为建立快速、灵敏检测欧洲樱桃绕实蝇的实时荧光定量PCR方法,本研究利用欧洲樱桃绕实蝇及其近似种类的线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列差异,设计筛选特异性引物和探针OYF/OYR/OYP,并对引物及探针特异性和灵敏性进行检测。结果表明,设计的引物和探针能够特异性检测出欧洲樱桃绕实蝇,灵敏度为0.001 ng/μL。     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。      

大豆茎溃疡病菌TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测

 The technique of TaqMan MGB real-time fluorescent PCR was established to detect Diaporthe phaseolorum var.caulivora (DPC) and D. phaseolorum var.meridionalis (DPM). The primers and TaqMan MGB probes were designed based on the ITS of DPC, DPM, D. phaseolorum var. sojae and Phomopsis longicolla. A series of genomic DNA dilution were used to detect sensitivity of the technique, the results showed that the limits of detection for DPM and DPC were 7 fg/μL and 6 fg/μL DNA respectively.     

金钱松实时荧光PCR鉴定方法的建立

本研究根据金钱松核糖体基因的内转录间隔区(ITS)设计特异性引物与荧光探针,建立了金钱松的实时荧光PCR检测方法.利用该方法检测4个不同来源的金钱松样本,均能够得到典型的扩增曲线,与53个松柏科其他树种如日本五针松、罗汉松、湿地松样本无交叉反应,表明了该方法的特异性.灵敏度可达1.6×10-5ng/μL.该方法可快速、...     

TaqMan探针实时荧光PCR快速检测苹果牛眼果腐病菌方法的建立

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malicorticis、N.perennans、N.alba和N.kienholzii)是我国检疫性植物病原真菌,为建立该病菌的实时荧光PCR检测法,根据病菌及其近缘种的翻译延伸因子(EF-1α)的保守序列设计了特异性探针,分别以苹果牛眼果腐病菌菌株和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。结果显示探针MAL-P、PER-P、ALB-P和KIE-P分别对N.malicorticis、N.perennans、N.alba和N.kienholzii表现特异性阳性扩增,而与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,单重探针和4种探针混合液的灵敏度分别达1 fg/μL和10 fg/μL DNA。总计从美国、智利、新西兰、法国进境截获的29批可疑病果的分离物中检测到PCR阳性荧光信号,包括20批N.perennans、8批N.alba和1批N.kienholzii。该方法在6 h内即可完成整个检测流程,其特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中苹果牛眼果腐病菌的快速检测。     

基于TaqMan MGB探针的花生矮化病毒检测研究

花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)是我国进境检疫性有害生物。本研究根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了PSV的实时荧光RT-PCR检测方法。方法特异性研究表明,针对PSV的2个不同株系PSV-E和PSV-W,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为20.10和21.22;而对于黄瓜花叶病毒、番茄不孕病毒、马铃薯Y病毒、菜豆荚斑驳病毒以及烟草环斑病毒等其他毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对PSV的检测。     

基于TaqMan MGB探针的可可花瘿病菌快速检测方法

可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段?     

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。     

仙人掌丛枝病植原体检测和16S rDNA片段序列分析

 对仙人掌丛生幼嫩组织进行超薄切片电镜观察,在韧皮部筛管中存在大量植原体;根据植原体16S rRNA基因保守序列设计的通用引物对R16 F₂/R₂,应用PCR技术对仙人掌丛枝病进行分子检测,结果扩增到约1.2 kb的特异性片段,而在健康组织中却没有此特异片段;通过16S rDNA片段核酸序列同源性比较,结果表明仙人掌丛枝病植原体与花生丛枝病植原体亲缘关系最近,据此可初步判断仙人掌丛枝病植原体是一种属于16Sr Ⅱ组的植原体,基本确定了其分类地位。     

基于TaqMan MGB探针的黑白轮枝菌检测方法

根据黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)及其近似种β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列差异,设计并合成1对引物和1条Taq Man-MGB探针,建立了黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测方法。对供试黑白轮枝菌及其近似种实验表明,该方法特异性强,只有黑白轮枝菌可被检出。通过对反应体系的优化,确定了最佳反应条件:引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.7μmol/L。灵敏度试验结果显示,最低检测限量为总DNA含量10 pg(20μL反应体系)。此方法快速灵敏,为快速检测黑白轮枝菌提供了重要参考。     

应用TaqMan探针进行马铃薯金线虫实时荧光PCR检测技术研究

马铃薯孢囊线虫是全球性的植物检疫性线虫,亦是我国重点关注的有害生物。针对马铃薯金线虫ITS序列,设计了引物和TaqMan 探针,使用15个马铃薯孢囊线虫群体和4个其他孢囊线虫样品进行验证,可高度灵敏地检测单个马铃薯金线虫的孢囊或幼虫,并可进行定量;最高检测灵敏度达到10fg;同时开展了混合样品和未知样品的检测,证明了引物的专化性和TaqMan探针的特异性。该检测方法可自动化检测马铃薯金线虫并进行定量,适合进行标准化的常规检测。