稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

UvWhi2 Is Required for Stress Response and Pathogenicity in Ustilaginoidea virens

Some stress response-related genes have been identified in Ustilaginoidea virens, but it is not clear whether and how defects of stress responses affect the pathogenesis processes of U. virens. In this study, we identified a general stress response factor UvWHI2 as a homolog of Saccharomyces cerevisiae Whi2 in U. virens. The relative expression level of UvWhi2 was significantly up-regulated during infection, suggesting that UvWHI2 may be involved in pathogenesis. Furthermore, knockout of UvWhi2 showed decreased mycelial growth, increased conidiation in the potato sucrose medium and a defect in pathogenicity. In addition, the RNA-Seq and phenotypic analysis showed that UvWHI2 was involved in response to oxidative, hyperosmotic, cell wall stress and nutrient limitation. Further studies revealed that the defects of stress responses of the ΔUvwhi2 mutant affected the formation of secondary spores on the nutrient limited surface and the rice surface, resulting in a significant reduction of pathogenicity of U. virens. Our results suggest that UvWHI2 is necessary for fungal growth, stress responses and the formation of secondary spores in U. virens. In addition, the defects of stress responses can affect the formation of secondary spores on the rice surface, and then compromise the pathogenicity of U. virens.     

UvSMEK1, a Suppressor of MEK Null,Regulates Pathogenicity,Conidiation and Conidial Germination in Rice False Smut Fungus Ustilaginoidea virens

Rice false smut, which is caused by Ustilaginoidea virens, is an emerging disease of rice spikelets in rice-growing areas worldwide. However, the infection mechanism of U. virens on rice spikelets is still unclear. Here, we characterized a suppressor of mitogen-activated protein kinase kinase or ERK kinase(MEK) null(UvSMEK1) in U. virens that is conserved among filamentous fungi. Compared with wild type U. virens strain P-1, Uv SMEK1 deletion mutants were defective in pathogenicity and conidial germination. In addition, conidiation of UvSMEK1 deletion mutants was significantly reduced on yeast extract tryptone(YT) plates, but increased in YT broth compared with the wild type. Compared with Uv SMEK1 expression level during the vegetative mycelia and conidiation stages, UvSMEK1 dramatically increased during infection of rice florets. Surprisingly, the Uv SMEK1 deletion mutants exhibited higher tolerance to H2 O2 and NaCl. In summary, presented evidence suggested that UvSMEK1 positively regulated pathogenicity, conidial germination and conidiation in YT broth, and negatively regulated conidiation on YT medium and tolerance to oxidative and osmotic stresses. The results enhance our understanding of the regulatory mechanism of pathogenicity of U. virens, and present a potential molecular target for blocking rice infection by U. virens.     

Ustilaginoidea virens: A Fungus Infects Rice Flower and Threats World Rice Production

Rice false smut disease, which is caused by the fungus Ustilaginoidea virens, is currently one of the most devastating rice fungal diseases in the world. Rice false smut disease not only causes severe yield loss and grain quality reduction, but also threatens food safety due to its production of mycotoxins. In this review, the most recent progresses regarding the life cycle, infection processes, genome and genetic diversity, pathogenic gene and disease resistance in rice were summarized in order to provide theoretical basis for the control of U. virens. We also proposed some future directions and key questions that need to be addressed for a better understanding of the molecular mechanism that leads to rice false smut disease and the prospects for sustainable control of rice false smut.     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析

稻曲病由稻曲病菌引起,是水稻穗部的重要病害。利用同源克隆和RACE技术,根据丝状真菌相对保守的氨基酸序列设计简并引物,从稻曲病菌中分离了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)编码基因的全长cDNA序列,命名为UvHog1。UvHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与稻瘟病菌MgOsm1(AAF09475.1)、球孢白僵菌BbHog1(AAS77871.1)、烟曲霉AfOsm1(XP752664.1)和隐球酵母CrHog1(AAM26267.1)等MAPK高度同源,相似性分别为95%、93%、88%和81%。系统聚类结果表明,UvHog1与酵母Hog1MAPK同源。在盐胁迫条件下,UvHog1的相对表达量明显降低,表明UvHog1参与了对盐胁迫的信号响应。     

小麦WRKY转录因子的鉴定及其在胚性愈伤组织形成中的表达分析

为研究WRKY转录因子在小麦胚性愈伤组织形成中的功能,以小麦基因组信息和愈伤组织形成发育过程中的转录组数据为基础,利用生物信息学方法,在全基因组范围内进行小麦WRKY转录因子的鉴定,并对小麦胚性愈伤组织形成过程中TaWRKY基因的表达模式进行分析。结果表明,在全基因组范围内共鉴定到270个小麦WRKY转录因子（TaWRKY01~TaWRKY270）,根据WRKY保守结构域数量和锌指结构域类型可分为I、II、III三组,分别包含41、145和84个。在愈伤组织转录组文库中,鉴定到39个TaWRKY基因,其中27个与在全基因范围内鉴定到的TaWRKY基因相同,12个在小麦愈伤组织中特异表达。差异表达分析表明,11个TaWRKY基因差异表达,大部分在胚性愈伤组织培养3～15 d时下调表达,且在胚性愈伤组织中比同时期非胚性愈伤组织中表达量高,推测部分TaWRKY基因可能参与小麦胚性愈伤组织的形成。     

水稻幼穗响应稻曲病菌毒素胁迫早期的转录组分析

【目的】由稻曲病菌引起的稻曲病不仅造成水稻减产,而且还会产生对动物和植物有毒的真菌毒素。探明水稻幼穗对稻曲病菌毒素胁迫响应的分子机制,可为发掘水稻抗稻曲病基因以及抗病分子育种开辟新的思路。【方法】用稻曲病菌毒素处理水稻幼穗,采用转录组测序技术对水稻幼穗进行转录组测序,以水稻9311基因组作为参考基因组进行对比,利用TPM法计算基因表达量,设定参数（差异倍数的绝对值不小于2,且q值不大于0.05）筛选差异表达基因。结合基因差异表达分析、富集功能分析,鉴定水稻响应胁迫的关键基因,并利用实时荧光定量PCR技术对差异表达基因进行验证。【结果】在稻曲病菌毒素胁迫12 h后,水稻幼穗出现2526个差异表达基因（DEG）;通过GO富集、KEGG代谢途经和KOG功能分析,将差异基因划分为GO功能下的64个条目、32个代谢途径和KOG功能下23个类别,包括淀粉和蔗糖代谢、苯丙类生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程。DEG中有66个植物转录因子,分属7种植物转录因子家族,包括WRKY和Myb两大转录因子。分析二萜类生物合成与淀粉和蔗糖代谢途径相关基因发现,OsCPS2、OsKSL4和细胞色素P450等基因表达量上调,而淀粉酶、β-呋喃果糖苷酶和UDP-焦磷酸化酶等基因表达量下调,推测这些基因在水稻响应稻曲病菌毒素胁迫时发挥重要的作用。【结论】稻曲病菌毒素作为非生物胁迫因素对水稻幼穗具有毒性;通过干扰淀粉和蔗糖代谢等途径而影响种子营养物质的合成,降低水稻抵抗病原菌侵染水稻的能力。     

基于加权关联网络分析的辣椒（Capsicum annuum L.）果实颜色转变相关基因的鉴定

辣椒属于茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum L.）一年生或多年生植物,其播种面积和产值在中国均居蔬菜首位。果色是辣椒众多经济性状中最直观的性状之一,直接影响人们的购买选择。辣椒果色受多种因素调控,相关色素生物合成的分子调控还需进一步解析。本研究以果实发育过程中呈现5种颜色的辣椒种质HNCA0076为实验材料,进行了生理检测、转录组测序以及WGCNA分析。在果实5个不同颜色时期,叶绿素含量变化较大,类胡萝卜素含量整体呈现递增趋势,类黄酮含量无明显变化,花色苷含量在紫色果期后逐渐降低,橙色果期后又逐渐升高。RNA测序数据质量满足进一步分析要求。4个转色期的上调（下调）表达基因数分别为826（276）、390（588）、1248（1800）和1528（2485）,随着果实的逐步发育,相邻比较组合中的差异基因的数量逐渐增加。差异表达基因经GO富集分析,主要集中在分子功能中的四吡咯结合、血红素结合、转移酶活性、氧化还原酶活性、铁离子结合和水解酶活性等过程;KEGG富集分析主要富集在类胡萝卜素生物合成、类黄酮生物合成和淀粉、蔗糖代谢等信号通路,其中类胡萝卜素代谢途径的3个基因在紫色时期向黄色时期的转变过程中表达上调,类黄酮代谢途径的11个基因在黄色时期向红色时期的转变过程中表达下调。4个对比组合差异基因分别注释到8877、8736、8689、8573个转录因子,共同注释到8049个转录因子,包括AP2、F-box、MYB和UDPGT等类型。利用非冗余的差异表达基因进行了加权关联网络分析,关联到4个与叶绿素、类胡萝卜素、花色苷、类黄酮含量相关的模块,进一步分析表明p450（LOC107859314）、Pkinase（LOC107839192、LOC107875415）、F-box（LOC107863894）和zf-MYND（LOC107852593）等29个转录因子可能参与辣椒果实转色的调控。本研究为进一步探索辣椒果实色素形成过程中的关键调控因子以及分析相关色素生物合成的调控提供了重要数据。     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

用木霉、类木霉对水稻纹枯病进行生物防治的研究

从腐烂稻草上分离到6个对水稻纹枯病菌有较强拮抗作用的菌株,经室内初步鉴定属于木霉、类木霉,经PDA平板拮抗试验表明,黄绿木霉的T3菌株抑菌率最大,为52.54%。纤维素酶活力测定试验表明,钩状木霉>黄绿木霉>绿粘帚霉,与抑菌试验结果并不同。田间试验结果表明它们对水稻纹枯病具有一定防效,以T1～T6混合菌喷施处理防效最好,可达32.25%,并对结实率和千粒重等产量因素有较大提高作用。     

特异性MAPK抑制剂U0126对玉米大斑病菌细胞膜透性及防御酶活性的影响

依据实验室前期研究发现,MAPK特异性抑制剂U0126对玉米大斑病菌分生孢子及附着胞发育、HT-毒素的产生和活性以及致病性都有着较显著的影响。以不同浓度的U0126处理玉米大斑病菌菌株,研究该抑制剂对病菌细胞膜透性及防御酶活性的影响。结果表明,U0126对病菌菌丝电导率和PAL活性均无显著影响,但对POD及PPO活性均有显著影响,且U0126对POD活性的影响具有浓度依赖性,即低浓度U0126可提高POD活性,高浓度U0126抑制POD活性;U0126对PPO活性的影响具有菌株特异性,且对菌株01-27的PPO活性的影响与对POD活性的影响相似,都具有浓度依赖性;随着U0126浓度增加菌株01-19的PPO活性反而显著下降。U0126对玉米大斑病菌细胞膜透性和苯丙氨酸代谢没有显著影响,但与过氧化物代谢和多酚代谢密切相关;U0126对过氧化物代谢和多酚代谢的影响具有一定的菌株特异性和浓度依赖性。     

茶树叶片响应茶饼病侵染的转录组分析

采用高通量测序技术对被茶饼病病菌侵染的茶树叶片进行转录组测序,筛选得到差异基因359个,其中248个上调表达,111个下调表达。差异基因中有216个获得GO（Gene ontology）数据库功能注释,主要涉及到生物合成过程、催化活性、细胞过程等诸多生理生化过程;KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库富集分析发现,共有106个基因被注释到47个代谢通路中,其中,单萜生物合成、卟啉和叶绿素代谢、核糖体、氮代谢、双萜生物合成、植物病原互作等通路显著富集。有32个差异基因被鉴定为转录因子,分布在16个转录因子家族中。利用实时荧光定量PCR（Real time quantitative PCR,qRT-PCR）验证了随机挑选的差异基因在感病叶片和未感病叶片中的相对表达量,与转录组测序结果的变化趋势一致。结果表明,茶树响应病原菌侵染是一个复杂的过程,大量基因被诱导或抑制表达,与抗病相关的转录因子被大量激活且上调表达。本研究为深入挖掘茶树抗病基因及进一步研究抗病分子机制提供了理论依据。     

水稻（脱氧）胞苷酸脱氨酶基因的表达特性分析

 以水稻为材料,系统探讨了水稻中（脱氧）胞苷脱氨酶基因的组织表达特性和胁迫诱导表达特性。实时PCR结果表明,7个编码（脱氧）胞苷脱氨酶的基因在苗期水稻根、茎和叶中的表达具有组织特异性,但这些基因在水稻茎中的表达都低于根和叶中的表达;同时,这些基因胁迫诱导表达特性也不尽相同,只有Os07g0245100的表达同时受到低温、干旱、高盐和病害侵染等多种胁迫的诱导。因此,（脱氧）胞苷酸脱氨酶在水稻中可能通过调节体内嘧啶核苷的水平从而在水稻的环境胁迫应答反应中发挥重要调控作用。     

单双液相下不同多酚氧化酶源对酶性合成茶黄素的影响

比较了单双液相条件下不同来源的多酚氧化酶对酶性合成茶黄素效率的影响。结果表明,在本试验体系下单双液相试验中,以不同的酶源合成茶黄素的试验效果不同,就茶鲜叶酶源而言,双液相明显比单液相的效果要显著,在单液相系统中总乙酸乙酯层茶黄素总含量达33.74%,合成率为14.245%,而在双液相系统中,其总含量达39.74%,合成率为31.792%;而就梨酶源处理而言,单液相的效果要比双液相稍好,在单液相系统中总乙酸乙酯层茶黄素总含量达45.73%,合成率为18.799%;而在双液相系统中,其总含量达40.20%,合成率为22.11%;就苹果酶源而言,单液相比双液相的效果要好些,在单液相系统中总乙酸乙酯层茶黄素总含量达18.22%,合成率为13.34%;而在双液相系统中,其总含量达11.56%,合成率为6.935%。     

花生生长素原初响应基因PNIAAs的表达模式分析

Aux/IAAs基因作为生长素早期应答三大基因家族之一,其成员能够在生长素诱导的早期做出响应,具有重要的理化功能。本研究通过筛选花生未成熟种子的cDNA文库,分离并获得了4个可能的Aux/IAAs基因家族成员,分别命名为PNIAA1、PNIAA2、PNIAA3和PNIAA4。RT-PCR对表达模式的研究显示,四个基因在花生各组织中为组成型表达,且具有不同的时空表达模式和特征,PNIAA1、PNIAA2和PNIAA4主要在叶中表达,而PNIAA3在种子中表达量较高,推测其可能在种子发育过程中行使功能;IAA对花生诱导表达模式分析显示,四个基因经IAA诱导后在根部的表达模式均有变化,其中PNIAA1、PNIAA2和PNIAA3能被生长素迅速诱导。