基于提高CRISPR/Cas基因编辑效率的研究进展

CRISPR基因编辑技术发展迅速,为功能基因的研究及遗传改良提供了技术支持。提高基因组编辑效率成为使用基因编辑技术的基本点,目前已取得了重要进展。本文结合CRISPR/Cas系统的作用原理、晶体结构,着重介绍目前提高编辑效率的最新研究进展,对CRISPR/Cas基因编辑效率的提高进行分析并提出改进策略。     

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因

【目的】半矮秆水稻品种的选育和应用是水稻育种的最重大成果之一。半矮秆品种大多是半矮秆基因SD1(semi-dwarf1)功能缺失突变体,为了获得sd1突变体,本研究对SD1基因进行了定向编辑。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以SD1基因为靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-SD1,用农杆菌介导的方法转化水稻恢复系申繁17和申繁24。【结果】在2个转化受体的T₀代均获得了纯合的sd1突变体,并且在T₁代株系中分离出了不含转基因序列的植株。2个品种的sd1突变体与各自的野生型相比,株高分别下降了25%左右。【结论】利用CRISPR/Cas9系统可以有效地对目的基因进行编辑,在水稻分子育种领域具有巨大的应用价值。     

茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高效抗除草剂水稻

【目的】培育抗除草剂品种在水稻育种中具有重要意义。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以黑龙江优质粳稻品种为材料,编辑乙酰乳酸合酶ALS基因,创制具有抗除草剂特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以乙酰乳酸合酶ALS为靶基因,构建单碱基突变载体pH-nCas9-PBE-ALS,以松粳22、龙粳46和绥粳18为转化材料,利用农杆菌介导转化获得转基因植株,通过对转基因植株的突变位点进行测序结合除草剂喷施试验,鉴定基因型及表型。【结果】经分子水平检测验证,获得ALS^S627N突变植株10株,ALS^S627N且¹⁸⁸⁴G-A但第628位氨基酸未改变突变植株1株,ALS^S627N/G628E突变植株1株。相较于野生型,以上三类突变植株均具有较强抗除草剂特性。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得具有抗除草剂特性,能够稳定遗传,不含转基因标记的纯合株系,可为抗除草剂水稻育种提供基础材料。     

基因编辑技术及其水稻中的发展和应用

CRISPR/Cas系统作为一种新兴的基因编辑系统,以其简单、高效、特异性高等特点已广泛应用于植物功能基因组研究和品种改良.在本文中,首先,我们系统总结了CRISPR/Cas技术及其衍生技术在植物中的开发和优化;其次,重点介绍了基于基因组编辑技术的水稻种质和品种改良的最新进展,并描述了基于基因编辑技术的水稻育种新策略,...     

利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,编辑原花青素转录调节因子Rc基因,恢复红种皮特性,以改良水稻米质,提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以Rc为靶基因,构建突变载体p YLCRISPR/Cas9-Rc-g RNA,以空育180、上育453为材料,转化获得转基因植株,通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种,其中KY-1在1414―1417bp缺失4个碱基,终止子突变为苯丙氨酸;SY-1在1411bp处缺失1个碱基,终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型,且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系,为红米改良提供基础材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻粒长和穗粒数性状

【目的】基因组定点编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究拟对GS3和Gn1a功能缺失突变对目标性状的改良效应进行分析,以期为培育高产水稻提供理论基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为编辑对象,构建了共敲除载体p C1300-2×35S::Cas9-g~(GS3)-g~(Gn1a)a,用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种,分析了基因突变的特征和相应农艺性状。【结果】构建的敲除载体成功地实现了对GS3和Gn1a基因的定点编辑。在4个转化受体的T_0代均分别获得了gs3和gs3gn1a的移码突变体。对T_1 代中无选择标记突变体的农艺性状分析表明,突变体gs3和gs3gn1a与野生型相比粒长变长,千粒重增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比,每穗粒数显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9系统进行水稻基因编辑可以快速改良品种的目标性状,在水稻品种的定向改良方面具有巨大的潜力。     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因,在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程,【方法】利用CRISPR/Cas9技术,在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体,分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异,都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基"A",导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因，在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程，【方法】利用CRISPR/Cas9技术，在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体，分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异，都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基“A”，导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑粒长基因GS3改善粳稻花时

【目的】花时不遇是影响杂交水稻制种产量的直接因素之一,已有研究表明水稻粒型差异对花时有影响。本研究采用GS3功能缺失突变来研究粳稻花时差异,以期为粒型影响花时提供佐证。【方法】利用CRISPR/Cas9技术来定向编辑控制粒长基因GS3,获得13对粒型差异的近等基因系粳稻,小区种植,采用目测法来调查花时。【结果】获得转基因T0植株并对其T1植株测序分析,发现长白25、吉粳102、浙粳88、武运粳27和J42均发生单碱基插入移码突变,垦鉴稻6号、空育131、浙粳22、扬粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938均发生部分碱基缺失突变。对T1植株粒型考查表明,gs3突变体的粒长均显著长于野生型。对稳定的后代花时统计分析发现,粒型变长的突变体均比野生型花时有所提前,且吉粳102、空育131、浙粳88、武运粳27、扬粳4227这5个材料的gs3突变体花时均显著早于野生型,其余材料开花也提早,但不显著。【结论】长粒型粳稻GS3突变体的花时早于短粒粳稻野生型,这一研究可为粳稻粒型育种提供参考,加速长粒粳稻亲本选育,有望推动杂交粳稻发展。     

CRISPR/Cas技术及其在作物遗传育种中的应用

简要概述了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas系统3种基因组编辑技术的工作原理,介绍了CRISPR/Cas技术在功能基因组学研究、候选基因功能分析(验证)、分子育种方面的应用及其在作物产量、品质、抗病性及水稻雄性不育系创制上的研究进展,提出该项技术在植物遗传育种应用中的新思路及安全性等研究方向。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

基因编辑技术的研究及在玉米中的应用

尽管人类已经发现并应用ZFN、TALEN基因编辑技术来实现对基因的定向改变,但由于操作复杂、成本较高,一直限制着基因组学的研究进展。基因的低成本、高效率、操作简单的编辑技术一直是生物分子领域亟待解决的问题。2013年《科学》(Science)杂志上两篇有关CRISPR/Cas的报道标志着基因编辑技术取得了重大突破。CRISPR是从细菌、古菌基因组中发现特殊的DNA重复序列家族。目前,该技术已经成功应用于水稻、斑马鱼、小鼠等动植物中,实现了对特定基因的定向修饰。简要介绍CRISPR/Cas的发现历史、组成、作用原理和最新研究进展,对该技术在玉米研究中的应用进行展望。     

基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析

以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。     

Production of Two Elite Glutinous Rice Varieties by Editing Wx Gene

The waxy gene(Wx) in rice, which encodes the granule bound starch synthase enzyme, is responsible for amylose synthesis. Glutinous(sticky) rice has little or no amylose that can be used in various applications, such as brewing. In this study, knockout of the Wx gene with CRISPR/Cas9 technology was conducted in two elite japonica rice lines, Huaidao 5(HD5) and Suken 118(SK118), aiming to develop elite sticky rice varieties. We achieved six homozygous T_0 plants with more than 200 bp deletion in the Wx gene, as well as 36 wx-HD5 and 18 wx-SK118 homozygous transgene-free plants in the T_1 generation. The seeds of all the mutants were white and opaque, similar to those of sticky rice, and contained only 2.6%–3.2% amylose. Results of scanning electron microscopy showed that the quality of rice did not change. In conclusion, we successfully developed two elite sticky rice varieties.