TAIL-PCR技术分离柞蚕丝素基因3’端非编码区未知DNA序列

以柞蚕基因组DNA为材料,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术分离出1 998 bp的DNA序列.将该序列与Genebank上的柞蚕丝素基因DNA序列(AF083334)进行比较分析结果表明,新钓取的DNA片断中1 758 bp的DNA序列为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列.TAIL-PCR技术为柞蚕丝素基因3′端非编码区未知DNA序列的钓取提供了一种简便、高效的方法.     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析

以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′ 端非编码区的765 bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1 263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%-100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。     

新疆巴州牦牛Lfcin基因的克隆与分子特征

利用PCR技术首次从新疆巴州牦牛基因组DNA中扩增获得了乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因exon 2编码区,其中含有乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因编码区序列;利用在线生物软件对Lfcin蛋白的结构进行预测.结果表明:克隆获得了含新疆巴州牦牛LF基因exon 2的DNA序列(GenBank:EU547256),共778 bp,其中LF基因exon 2编码区长165 bp,Lfcin基因编码区长75 bp;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;各物种的Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测的Lfcin 3D模型显示,Lfcin为一段由α-螺旋和β-折叠组成的"U型"结构.首次从新疆巴州牦牛品种中克隆获得Lfcin基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛Lfcin蛋白基因工程和蛋白质功能方面的研究奠定了重要基础.     

虹鳟鱼NDK-1 基因cDNA的克隆与序列特征分析

以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼NDK-1基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:(FJ607868).序列全长953 bp,其中5'端非翻译区(5'-UTR)长45 bp,3'端非翻译区(3'-UTR)长284 bp,开放性阅读框(ORF)长624 bp,编码207个氨基酸.虹鳟鱼NDPK蛋白序列与几种脊椎动物台湾樱花钩吻鲑、斑马鱼、西方爪蟾、非洲爪蟾、人和黑青斑河的同源性分别为95%,72%,68%,68%,65% 和 64%,表明NDK-1基因在进化过程中是高度保守的.     

百子莲开花相关基因ApVIN3的克隆及表达分析

研究以百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis)茎尖组织为材料,利用RACE (cDNA末端快速扩增)方法,获得百子莲VIN3基因c DNA全长序列,命名为ApVIN3,GenBank登录号为KJ472789。序列分析表明,百子莲ApVIN3基因cDNA全长1 943 bp,其中开放阅读框为1 680 bp,编码559个氨基酸,5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别为88和175 bp。ApVIN3编码一个具有C4HC3 (cys4-His-cys3)保守序列结构的PHD-finger蛋白,与二穗短柄草(XP＿003573553.1) VIN3蛋白有很高的相似性。实时荧光定量分析表明,ApVIN3在百子莲茎尖中的表达量受温度调控的影响,其表达量随着低温时间的延长逐渐上升。ApVIN3可能在百子莲成花诱导过程中发挥着重要的作用。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

朝鲜碱茅BADH基因3′端及5′端部分序列的扩增

为探索朝鲜碱茅的耐盐,耐寒和耐旱的抗性机理,从已知禾本科植物朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的一段保守区序列,以此序列为研究基础,结合其他禾本科植物的BADH基因保守区序列设计引物,扩增出朝鲜碱茅BADH基因3′端序列及5′端部分序列共1 502 bp。经BLAST比对,结果表明,获得到的朝鲜碱茅BADH基因序列与羊草和大麦的BADH基因的同源性达到89%,含有保守的十肽序列和其后29位与酶功能有关的Cys。     

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。     

富有柿果实ACC合成酶3′末端的cDNA克隆

利用3’RACE的方法对柿果实ACC合成酶基因的3’末端进行扩增,扩增产物克隆到pMD18－T Vector载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a,蓝白斑筛选重组质粒,并对插入片段进行序列测定。结果表明,3’RACE产物长912bp,开放阅读框内核苷酸序列编码251个氨基酸,此氨基酸序列含有ACC合成酶中3个高度保守区,GenBank中登录的DK－ACS1（登录号AB073005）序列只有一个的氨基酸不同。终止子后面的3’非编码区的长度为155bp,其中只有一个核苷酸与DK—ACS1的3’序列非编码区不同。序列分析结果显示,克隆的片段含有5’端GSP Inner Primer和3’端为RACE Inner Primer的引物。     

三色堇4,5-多巴雌二醇双加氧酶基因的克隆及生物信息学分析

本实验以三色堇(Viola wittrockiana)的花瓣为研究材料,提取其总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术扩增4,5-多巴雌二醇双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。本实验成功克隆VwDODA的cDNA全长1 055 bp,其中3'端非编码区157 bp,包含29 bp Poly(A),5'端非编码区103 bp,其开放阅读框为795 bp,编码263个氨基酸。通过NCBI的BLAST比对表明VwDODA编码的氨基酸序列与其他植物相关基因的相似性达到80.29%,与大豆(Glycine max)亲缘关系最近。通过生物信息学分析软件对VwDODA的蛋白质结构与功能进行预测,结果表明Vw D-%ODA是一种亲水稳定蛋白,不存在跨膜区域和信号肽,分子式为C1337H2026N356O384S7,等电点为6.70,分子量为29 455.37。本研究为将来三色堇中甜菜色素与花色素的互斥现象研究打下了基础。     

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。     

中间锦鸡儿CiMYB185基因克隆及表达分析

为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理,本研究以中间锦鸡儿为试验材料,从实验室已建立的转录组数据库中选取转录因子CiMYB185编码基因作为研究对象。利用PCR技术分别以cDNA与g DNA为模板对CiMYB185基因进行全长克隆。测序结果表明:CiMYB185基因的开放阅读框为909 bp,编码303个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 592 bp,含有1个内含子和2个外显子。序列分析发现该基因所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB类蛋白;利用染色体步移技术克隆得到908 bp的ATG上游启动子序列,序列中包含一些与光反应和激素相关的元件。该研究为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理奠定了基础。     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。     

紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

茶树生长素响应因子基因CsARF1的克隆与表达分析

生长素响应因子(ARFs)是能够与生长素原初反应基因启动子区的生长素响应基元(TGTCTC)特异结合的一类转录因子,调控生长素应答基因的表达。采用SMART-RACE-PCR技术,获得茶树生长素响应因子基因CsARF1的全长cDNA序列(GenBank登录号为JX307853),并进行了生物信息学分析和表达分析。CsARF1基因cDNA全长3222 bp,包含2463 bp的开放阅读框(ORF),编码820个氨基酸残基。编码蛋白的分子量为49.35 kD,具有保守的N端DNA结合域B3和C端二聚化结构域IAA_ARF,中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有激活转录功能的可溶性蛋白。相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列与葡萄ARF8的相似性最高(83%),与番茄ARF8的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同时期的表达情况。结果显示CsARF1在茶树越冬芽深休眠和萌动期表达量较高,表明该基因与茶树越冬芽的休眠维持及解除密切相关。     

胡杨耐盐基因PeuHKT1的克隆与表达分析

阳离子转运载体HKT(high-affinity K~+transporter)类蛋白既是高亲和的K~+转运载体,也是一种Na~+转运体,具有Na~+和K~+转运的双重功能,对调节细胞内Na~+/K~+动态平衡起着决定性作用。胡杨长期生长在盐渍化和干旱的土壤环境,对高盐和干旱形成了极强的适应能力,是典型的耐盐抗旱植物,成为研究多年生林木抗逆适应机制的理想材料。以胡杨根系为材料,本研究克隆鉴定了一个胡杨Peu HKT1基因,该基因含有3个外显子和2个内含子;其c DNA全长为1 076 bp,包括13 bp的5'端非翻译区(5'UTR)和232 bp的3'端非翻译区(3'UTR);长831 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)可编码276个氨基酸;其编码蛋白含有丰富的α-螺旋,存在多个跨膜结构域,蛋白质相对分子量(MW)为31.54 k D;理论等电点(p I)9.36;实时定量PCR技术构建了Peu HKT1基因在高盐胁迫条件下的动态表达模式,探讨了该基因参与胡杨高盐胁迫响应的信号转导途径。