爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化

以爬行卫矛(Euonymus fortunci var.radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株.结果表明,0.5 mg/LBAP和0.01 mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个.将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中.遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率.     

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立

以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。     

甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。     

观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建立

观赏羽衣甘蓝是一种赏食兼用的耐冻优良景观植物。为了通过基因工程手段赋予其抗虫性,并进一步提高其低温耐受性,获得新的抗性种质,本研究以优良育种品系为试材,详细探讨了影响离体培养不定芽再生的因素,建立了高效再生体系。以8份不同类型羽衣甘蓝基因型的带柄子叶、子叶、下胚轴为外植体,研究了不同基因型、不同外植体、不同的培养基激素浓度配比及添加AgNO3对不定芽诱导的影响。结果表明:无论基因型及使用的培养基,带柄子叶均为最佳外植体;不同的基因型、不同外植体其最佳的芽诱导培养基不同;筛选出两份材料,其带柄子叶分别在L6(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L)及L3(MS+6-BA1.5mg/L)培养基中不定芽诱导率为100%,下胚轴诱导率最高也能达88.33%;培养基中添加4mg/L AgNO3不利于羽衣甘蓝的不定芽诱导;再生株生根以MS+NAA0.1mg/L效果好,生根率可达100%。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。     

阔叶猕猴桃抗生素敏感性及遗传转化的研究

以阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia)叶片为外植体,研究了各种抗生素对形态分化和器官形成的影响,并以叶盘为受体,通过根癌农杆菌介导法获得了抗性愈伤组织和抗性芽,组织化学染色表明gus基因已在植物组织中表达。研究结果表明,对不定芽分化来说,头孢霉素(Cef)效果明显好于羧苄青霉素(Carb)。Cef浓度为300mg.L-1时效果最好,再生频率达100%,平均再生芽数达最大为9.76个芽/外植体。生根过程中高浓度的Cef(≥200mg.L-1)明显抑制生根,而Carb对生根没有显著影响。在卡那霉素(Kan)和Carb组合处理中,Carb对生根没有显著影响,但Kan明显抑制生根。随着Kan浓度的升高,生根率和平均根数迅速减少,当浓度升高到50mg.L-1时,生根完全被抑制。因此,农杆菌介导的阔叶猕猴桃遗传转化中愈伤组织和不定芽诱导过程宜选用300mg.L-1Cef来抑制农杆菌生长,Kan筛选的临界浓度为20mg.L-1。在抗性芽生根过程中Kan浓度应该控制在50mg.L-1以内,并改用Carb作为杀菌剂,生根效果会更好。该研究确定了农杆菌介导的阔叶猕猴桃叶片遗传转化中使用抗生素的种类和用量,为通过基因工程对阔叶猕猴桃进行遗传改良奠定了基础。     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

黑果枸杞高效植株再生与遗传转化体系的建立

为建立高效的黑果枸杞组织培养与遗传转化体系,本研究以黑果枸杞叶片、茎节、茎段为外植体,在含有不同浓度组合的NAA和BAP培养基上进行愈伤组织和不定芽诱导比较;选择黑果枸杞叶片为材料,采用农杆菌介导法,将带有绿色荧光蛋白基因(sGFP)的双元表达载体导入黑果枸杞,探讨侵染时间和抗生素浓度对遗传转化效果的影响。结果表明,黑果枸杞的最适植株再生体系为:以叶片为外植体,MS基本培养基中添加0.5 mg·L^-1NAA和0.3 mg·L^-1BAP,愈伤组织诱导率为88.56%,不定芽诱导率为54.54%,将不定芽置于1/2MS培养基中进行生根诱导,生根率为95%;稳定高效的遗传转化体系为:农杆菌侵染液OD₆₀₀为0.25,共培养3 d,卡那霉素(kanamycin)和羧苄西林(carbenicillin)浓度分别为25和250 mg·L^-1。愈伤组织和不定芽诱导时经卡那霉素和荧光标记双重选拔,愈伤组织阳性率为85.47%,出芽生根后经PCR鉴定,阳性转化率为29%;利用实时荧光定量PCR检测转基因植株,导入的外源sGFP基因均有较高的表达水平。本研究为利用基因工程技术对黑果枸杞进行品种改良提供了技术支撑。     

根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化

报道了根癌农杆菌（Agrobacterium tumifaciens）介导的蓝猪耳（Torenia foumieri）遗传转化的方法。筛选蓝猪耳转化芽的最适卡那霉素（Kan）浓度为400mg／L；以稀释10倍的菌液浸染叶盘10～20min，固体共培养基（含20μmol／L乙酰丁香酮）上23℃共培养7～8d可获得转化芽诱导率27．2％；16h光照，8h黑暗是较理想的共培养光周期；茎段作为外植体，其转化芽诱导率要高于叶盘的转化芽诱导率，而且其转化芽比叶盘的转化芽健壮；1／2MS＋100mg／L Kan＋0．5mg／L IAA是比较理想的生根培养基。实验结果表明，根癌农杆菌介导的蓝猪耳转化获得了抗性再生植株，转化率为24．1％。     

新铁炮百合遗传转化体系的建立及zm401基因的导入

以培育无花粉百合新材料为目的，进行了新铁炮百合遗传转化技术的探索。结果表明，以新铁炮百合无菌苗小鳞片为外植体，在附加1.0 mg/L 6-BA 和1.0 mg/L NAA的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株，再生率达100%。农杆菌介导的遗传转化中，外植体预培养2 d，侵染5 min，共培养5 d，获得12‰的转化率。以此方法用玉米花药发育相关基因zm401转化受体材料，经PCR和PCR-Southern检测证实，zm401已经成功地整合到转化植株基因组中。该研究结果为获得无花粉百合中间材料奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的甘蓝高效稳定的遗传转化系统的建立及对CpTI基因转化的研究

通过对影响根癌农杆菌转化的多种因素的比较和探索后，建立了一种以农杆菌介导的高效和稳定的甘蓝遗传转化系统。选择目前在生产上大量推广应用的6个优良甘蓝品种，用其无菌苗的下胚轴作为外植体，经《农杆菌LBA4404（含质粒pBin-TI-19-2)感染，在含卡那霉素50mg/L的抗性培养基上筛选，80％的外植体表现出抗性，形成愈伤组织并进一步分化成苗。每块愈伤组织最低成苗5株，最高可达22株。对部分抗性植株的总DNA进行Southern杂交，结果表明T－DNA上的CpTI基因已整合到甘蓝基因组中，外源基因的转化频率高达20％。通过抗小菜蛾实验发现，转基因植株未转基因植株有明显的抗性。     

狗蔷薇类原球茎遗传转化体系的建立

在本实验室建立的狗蔷薇（Rosacanina）类原球茎（PLB）再生途径基础上,以类原球茎为转化受体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,GV3101菌株）介导法,通过评价类原球茎GUS基因瞬时表达率,采用正交试验设计优化狗蔷薇遗传转化条件,建立遗传转化体系。最佳转化条件为：用OD600值为0．6的农杆菌菌液侵染狗蔷薇类原球茎30min,然后在含有100μmol／L乙酰丁香酮的MS培养基上共培养2d,利用此优化的转化系统,经组织化学染色及PCR检测获得了转GUS基因阳性植株。     

发根农杆菌介导转化小金海棠的影响因素

为了研究发根农杆菌介导的小金海棠的遗传转化体系,采用农杆菌侵染的方法,对影响Ri质粒诱导小金海棠产生发状根的各种因素进行了研究,结果发现,Ri质粒转化小金海棠形成发状根的效率,受发根农杆菌种类、浓度、生理状态及小金海棠外植体的种类、外植体在菌液中的侵染时间、共培养时间、基本培养基等多种因素的影响,加入20mg/L AS对转化效率影响不大。采用稀释5倍的处于对数生长期的8196菌株,感染小金海棠无菌苗幼嫩叶片5-10min,在MS培养基上共培养2d后转入含卡那霉素10mg/L、头孢霉素250mg/L的1/4MS诱导培养基上培养一个月,发根诱导效率最高可达93.3%.随机选择50条诱导的发根进行GUS染色,结果发现有96%发根GUS染色呈阳性。对48条GUS阳性的发根进行PCR检测,其阳性率为100%。高效的发根诱导体系为发根的进一步再生及转入外源基因奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化

以马铃薯品种PB 04的叶片和茎段为外植体,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对马铃薯遗传转化效率的影响,以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影响,结果表明:(1)在玉米素(ZT)2 m g/L,萘乙酸(NAA)0.01 m g/L条件下能有效地提高马铃薯愈伤组织分化率;(2)外植体经过2 d的预培养,在OD600=0.8的农杆菌菌液中侵染10 m in后,抗性愈伤诱导率最高。(3)头孢霉素(C ef)比羧苄青霉素(C ar)更适合用于马铃薯外植体的遗传转化。(4)农杆菌侵染后恢复培养5~7 d再加入卡那霉素(Km)50 m g/L能有效地提高外植体的转化率。     

根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究

利用带有内含子gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导"鬼露甘"草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg/L,可明显抑制非转化组织的生长;300mg/L的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。     

根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究

以山定子叶片作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间对转化的影响。结果表明:预培养不利于山定子转化;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响;侵染10min,共培养3d抗性芽百分率最高;转化后叶片再生培养基的最佳激素配比为NAA1.0mg/L+BA2mg/L+TDZ4mg/L。抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。