EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

转双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉与非转基因棉生物学特性差异的研究

以双价抗虫抗除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉为观察品种,非转基因棉赣棉11号为对照品种,进行了棉花生育性状、产量性状等的比较和评价研究。结果表明:与对照品种相比,双价抗虫抗除草剂基因棉在成铃至吐絮期株高增长显著(超速6.6～9.1 cm);在盛铃期之前成铃变缓极显著(少10.7个铃);花铃期至盛铃期果枝层生成慢显著(少1层);果枝角度变大极显著(大2.1°);主茎节距拉长极显著(长0.6 cm);叶色加深显著;衣分率降低极显著(低1.7%);籽指升高极显著(高1.77 g);纤维整齐度指数升高显著(高1.325%);纺纱均匀指数增加显著(增7.5);籽棉、皮棉、霜前籽棉、霜前皮棉均减产极显著。初步评价:双价抗虫抗除草剂基因棉的生育性状、产量性状较差,纤维纺纱性状较好,推广种植性较差。     

转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性分析

为了对转基因抗虫玉米转育株 Bt 蛋白的表达特性进行分析,用Cry1Ab/Cry1Ac 平板试剂盒定量检测了3种含 Bt 基因的玉米回交后代品系 BC₁F₁ ( HZ3152、HZ3342、HC0142 ) 在相同生长时期不同组织和不同生长时期相同组织中 Bt 蛋白的表达量。结果表明,在乳熟期 BC₁F₁ 不同组织中 Bt 蛋白表达含量的高低顺序为: 叶片 ＞胚乳＞花丝＞种子苞叶;在BC₁F₁不同的生长发育阶段 ( 苗期、抽丝期和乳熟期 ),叶片中 Bt 蛋白的含量随生育期的推移呈明显先上升后下降趋势, Bt 蛋白含量在抽丝期达到最大,之后又开始下降;苗期 ( HC0142、HZ3152、HZ3342） Bt 蛋白的含量 (4.16、3.75和3.72 μg·g^-1 ) 和乳熟期 (5.56、4.58和4.79 μg·g^-1 ) 的含量分别是抽丝期 (6.05、5.36和5.50 μg·g^-1) 的 68%、69%、67% 和91%、85%、87%。一般在玉米生长后期 Bt 蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。该研究表明 Bt 蛋白在玉米回交后代中可以稳定表达,对 Bt 的相关研究为转基因育种等提供了参考依据。     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的检测技术与生存竞争能力研究——基于草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下

此研究为国家转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉环境安全评价技术建立而设。在草甘膦压力和对靶标害虫不防治环境下的检测技术,以杂交抗虫棉赣棉杂1号和非转基因棉赣棉11号为2个对照,来检测评价转抗虫抗草甘膦除草剂基因(Cry1Ac+EPSPS)棉的生存竞争能力。结果:转Cry1Ac+EPSPS棉与两个对照相比不显示抗虫优势;株高增长无竞争力;覆盖度有不显著的弱竞争力;单株成铃、单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分率、脱落率、籽棉产量、皮棉产量与赣棉杂1号比呈现显著或极显著的负竞争优势,与赣棉11号比无竞争优势;果枝层数前期与两对照相比有极显著的负竞争优势,后期与赣棉杂1号比无竞争优势,与赣棉11号比有显著的负竞争优势。结论:转Cry1Ac+EPSPS棉推广种植可行性较差。本项检测技术和评价方法有较好的适用性。     

转双价抗虫抗除草剂基因棉栽培地生存竞争能力研究

此研究为国家转双价抗虫抗除草剂棉花环境安全评价技术建立而设。结果：转双价抗虫抗除草剂基因棉在吐絮期株高生长竞争优势达显著水平,超对照9.12 cm;吐絮期棉花覆盖度竞争优势达极显著水平,超对照100.5个百分点;产量竞争优势不显著,籽棉超对照66.92 kg/亩,皮棉超对照21.14 kg/亩;发芽率无竞争优势,低于对照0.5个百分点。与非转基因常规棉相比,转双价抗虫抗除草剂基因棉总体上生存竞争能力具有优势。     

转基因复合抗虫耐除草剂玉米BFL4-1的分子特征及功能评价

玉米螟和田间杂草严重影响我国玉米的生长发育,导致玉米产量和品质下降.培育具有抗虫、耐除草剂等复合性状的转基因玉米成为转基因玉米育种的一个趋势.将cry1Ab、cry1F和cp4epsps构建在同一载体上并利用农杆菌转化到玉米Hi-Ⅱ中,通过与玉米自交系郑58进行回交转育,获得了具有郑58遗传背景并兼具抗虫和耐除草剂性状...     

转Cry1Ca和Bar基因水稻的获得与性状鉴定

本研究以光温敏核不育系P88S为受体材料,用农杆菌法进行转化,并对获得的转基因植株进行分子鉴定及性状鉴定。结果显示:Bar基因和Cry1Ca基因在水稻P88S中成功整合并表达。光温敏核不育系P88S经过转基因后育性发生改变,表现出一定的可育度。转基因后P88S的谷粒宽及千粒重与对照之间的差异达到了极显著水平。     

双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测

用限制性内切酶HindⅢ酶切分别含有CryIA(α)和CryIA(c)基因的pGEM—4zf质粒得到Ubiquitin(玉米泛素)基因启动子驱动的CryIA(α)和CryIA(c)基因表达盒，将它们分别插入到用HindⅢ开环的pCAMBIA3300(含编码抗除草刑草丁辟的bar基因)载体上形成中间载体p3300—bt。采用Pfu高保真DNA聚合酶用PCR的方法从质粒pBI121-ptα上扩增得到含CaMV35S启动子和NOS终止子的ptα基因表达盒，然后插入到用Smα Ⅰ切开的中间载体p3300—bt中。获得带有抗性基因的双价抗虫基因表达载体p3300—bt—ptα。通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种百日红，获得一批抗除草刑的转基因烟草植株。     

基于柑橘叶斑驳病毒的表达载体构建及应用

【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。