拟南芥下胚轴向光弯曲P2SA2基因的克隆与功能鉴定

向光素PHOT1介导较宽范围蓝光诱导的下胚轴向光弯曲,而向光素PHOT2仅在强蓝光下起作用。强蓝光下,PHOT1和PHOT2介导拟南芥下胚轴向光弯曲的功能冗余性,限制了人们对PHOT2功能的研究。为此,以拟南芥phot1突变体为材料,避开PHOT1基因的干扰,通过EMS诱变筛选拟南芥下胚轴向光不弯曲突变体,成功克隆到1个基因,命名为P2SA2(phototropin 2 signaling associated 2),该基因被证明是NPH3的等位基因。P2SA2基因的突变可导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应。在p2sa2突变体背景下,P2SA2基因超表达可恢复强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲。该结果将为强蓝光下PHOT2下游基因的筛选、功能鉴定和揭开PHOT2调节强蓝光诱导的下胚轴弯曲的机制提供理论基础。     

玉米隐花色素CRY1b和CRY2基因转录丰度对不同光质处理的响应

玉米株高、开花期、产量、品质等性状与环境中的光密切相关。隐花色素是一类蓝光和近紫外光的受体, 主要参与植物的光形态建成及动、植物的生物钟调控。通过研究玉米隐花色素基因对不同光处理的表达模式, 可为进一步研究其对玉米光形态建成的作用奠定基础。本研究采用RT-PCR技术克隆了玉米ZmCRY1b和ZmCRY2基因; 利用生物信息学相关网站和软件对其编码蛋白的结构域及氨基酸进行了系统发育分析; 利用qRT-PCR分析了玉米自交系B73中ZmCRY1b和ZmCRY2基因在不同组织、以及响应不同光质及长日照和短日照处理的转录丰度。研究发现, 玉米与拟南芥、水稻和小麦的CRY蛋白有相同的结构域及较高的氨基酸序列的一致性, 表明它们具有相似的功能。ZmCRY1b和ZmCRY2基因主要在玉米的叶片中表达; 二者能迅速响应各种持续光质、黑暗到不同光质转换及长日照和短日照处理, 且ZmCRY1b在各种处理下的转录丰度均高于ZmCRY2, 可能暗示ZmCRY1b在玉米中功能更强。以上研究结果表明, ZmCRY1b和ZmCRY2基因均能有效地响应各种光质和光周期处理, 并在玉米的光形态建成中发挥重要作用。本研究为进一步探明ZmCRY1b和ZmCRY2基因的功能及其在玉米品种改良中的应用提供了研究基础。     

亚麻荠油脂相关转录因子CsLEC2基因家族的鉴定及表达分析

对亚麻荠CsLEC2家族进行全基因组鉴定、半定量RT-PCR、qRT-PCR,检测CsLEC2基因的时空表达特性并通过转录组数据预测CsLEC2下游靶基因,以解析CsLEC2调控亚麻荠种子油脂合成和积累等生物学功能。结果表明,在亚麻荠基因组中共鉴定到3个亚麻荠CsLEC2基因（CsLEC2.1、CsLEC2.2和CsLEC2.3）。蛋白理化性质和高级结构分析显示,亚麻荠CsLEC2蛋白具有与拟南芥AtLEC2相似的理化性质,且其二级结构的主体也相似。系统进化分析表明,亚麻荠CsLEC2蛋白与模式植物拟南芥AtLEC2蛋白及拟南芥琴亚种AlLEC2蛋白亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示亚麻荠CsLEC2在未成熟的种子中高表达。转录组数据分析显示下游基因CsWRI1和CsOLE3高表达,推测CsLEC2可能直接上调CsWRI1和CsOLE3的转录表达,参与油脂代谢调控。     

拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作蛋白的筛选与分析

前期研究中从拟南芥突变体库中筛选获得一株对灰霉病菌侵染表现为感病的突变体。利用TAIL-PCR等技术克隆获得拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22。为了进一步明确T1N6_22在拟南芥抗灰霉病过程中的调控机制,利用酵母双杂交技术(Y2H),以构建成功的p AS1/T1N6_22蛋白为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库。通过酵母双杂交筛选,共获得28个酵母克隆。利用T1N6_2基因特异性引物鉴定酵母阳性克隆,并进行测序。共获得了4个可能与T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析发现,AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分别为核小体装配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸还原酶和硫胺二磷酸盐结合折叠超家族蛋白,分别参与到核糖体装配、泛酸盐合成、植物代谢等过程中。研究结果为确定T1N6_22蛋白的互作蛋白,阐明其调控拟南芥抗灰霉病的分子机制奠定了基础。     

木榄超活性突变基因BgSOS1-3000的分离及功能分析

采用PCR的方法,分离到木榄质膜Na~+/H~+逆转运蛋白基因BgSOS1 3'-末端缺失的突变基因BgSOS1-3000。BgSOS1-3000缺少了SOS1蛋白末端的自抑制区。构建酵母表达载体BgSOS1-pYPGE15和BgSOS1-3000-p YPGE15,在酵母突变体AXT3K中分析它们的功能,结果发现与转全长BgSOS1基因的酵母相比,转突变基因BgSOS1-3000的转基因酵母耐盐性更强,可在200 mmol/L Na Cl条件下生长,而且超活性突变体增强耐盐性不依赖于植物体内的SOS2/SOS3蛋白复合体。通过测定转基因酵母的离子含量,发现转BgSOS1-3000基因的酵母中的Na+显著低于转BgSOS1基因的酵母,说明BgSOS1-3000超活性突变体通过外排更多的Na+能提高酵母的耐盐性。这为提高植物耐盐性提供了新材料。     

谷子黄叶色突变体ylm-1的精细定位与功能分析

谷子叶色突变体在研究C₄光能利用效率和叶绿素代谢机制方面具有重要作用。为探究谷子叶色突变的分子机制,利用甲基磺酸乙酯（EMS）处理谷子品种豫谷1号,获得1个稳定遗传的黄叶色突变体ylm-1。通过表型和遗传分析及遗传背景检测,同时利用突变位点图谱（MutMap）技术对突变基因进行精细定位。结果表明,ylm-1整个生育期叶色均为淡黄色;ylm-1与野生型遗传背景相同且受1对隐性核基因控制;MutMap精细定位到第9号染色体关联区间内共13个非同义突变基因,其中,Seita.9G249900是一个编码与红叶绿素代谢还原酶（RCCR）相关的基因,该基因位于第9号染色体19 937 988与19 940 620bp之间,含有2个外显子和1个内含子,在第2外显子361bp处发生A/T碱基突变,导致1个谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）。根据突变碱基设计了dCAPS标记,进一步验证了ylm-1候选基因突变位点。黄叶色突变体ylm-1的鉴定与基因功能分析将为该基因的有效利用、功能验证及作用机制研究奠定理论与技术基础。     

水稻极矮突变体s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究

通过EMS诱变日本晴获得1个极端矮化突变体s2-47,其表型为极度矮化、叶色深绿、不能抽穗结实。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明s2-47突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示s2-47应与赤霉素的生物合成有关。利用s2-47和Dular构建F₂群体并精细定位表明,s2-47的表型与水稻OsCPS1基因紧密连锁,其编码的柯巴焦磷酸合成酶是赤霉素生物合成途径的第一个关键酶。序列分析发现,s2-47突变体的OsCPS1基因编码区发生了单个碱基缺失导致移码突变。OsCPS1基因在植株地上部都有表达,在节中表达最高。OsCPS1基因的表达受外源GA₃抑制,但在s2-47突变体中表达上调。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

一个新的玉米Vp15基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

在玉米繁种过程中发现一个玉米穗发芽突变体(viviparous), 命名为vp-like4。经过连续多代自交发现该突变体性状能稳定遗传, 并且表现为隐性单基因控制。以vp-like4与自交系Mo17杂交构建F₂遗传定位群体, 利用BSR-Seq方法, 将目的基因定位于玉米第5染色体173.8~175.6 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现, 在此定位区间内存在一个已报道的Vp15基因。Vp15基因编码钼喋呤合酶小亚基, 参与类胡萝卜素裂解为ABA的过程。利用2个独立的vp15突变体vp15-umu1和vp15-DR1126的杂合体, 分别与vp-like4突变体杂合体做杂交进行等位测验, 发现杂交后代中正常籽粒与穗发芽籽粒比例符合3∶1分离比。基因组序列分析发现vp-like4突变体中Vp15基因在第2外显子末端及3°非翻译区有60个碱基的缺失, 与所报道的vp15突变体vp15-umu1、vp15-DR1126均在第2个外显子有Mutator转座子插入的突变方式不同。进一步通过RT-PCR检测发现, vp-like4突变体中Vp15基因的表达量显著降低。以上实验证据表明, vp-like4是一个新的Vp15基因等位突变体。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

一个新的玉米silky1基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

前期试验发现一个玉米雄性不育突变体(male sterile mutant),命名为msm-6。经过连续多代杂合单株自交发现该突变体性状能稳定遗传,遗传模式分析表明该突变体为单个隐性1核基因控制。以msm-6与自交系B73杂交构建F2遗传定位群体,利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法,筛选到与msm-6位点连锁的4个SSR标记,即C6-24、C6-30、C6-34和C6-40。进一步采用444个F2单株对这4个连锁标记验证,将msm-6定位于标记C6-24与C6-34之间,即玉米第6染色体68.5～98.1 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现,在此定位区间内存在一个已报道的Silky1基因。Silky1基因编码MADS-BOX蛋白,是参与花器官建成ABCD模型的B功能基因,该基因的突变会造成雄花不育、雌花花丝增多等表型。利用杂合体+/silky1-mum3与纯合突变体msm-6/msm-6杂交进行等位测验,杂交后代中正常植株与突变植株分离比例符合1∶1。基因组序列以及转录本序列分析发现,msm-6突变体中第6个内含子5'端供体位点AG/GTAAG (外显子/内含子交接处)的序列+1位G突变为C,导致第6外显子被错误剪切掉,产生了第6个外显子缺失的Silky1异常转录本。以上实验证据表明,msm-6与所报道的由mutator转座子插入造成的Silky1突变体silky1-mum2、silky1-mum3和silky1-mum4的突变方式不同,是一个新的Silky1基因等位突变体。msm-6的发现与鉴定为进一步深入解析玉米穗花器官决定的遗传机制提供丰富的实验材料,同时也为RNA加工过程中剪接位点保守性提供重要证据。     

甘蓝BoPINs家族基因的特征和表达分析

为了探索植物生长素极性运输载体蛋白编码基因BoPINs家族参与甘蓝自交不亲和性的成员数目与参与方式,本文通过转录组分析获得BoPINs家族在甘蓝自花和异花授粉后的表达情况,利用分子生物学技术和生物信息学方法对该家族的基因结构、蛋白进化亲缘关系和表达模式等特征进行分析。结果表明,甘蓝BoPINs基因家族包含8个成员,含有5~9个外显子和4~8个内含子;其编码的蛋白质的氨基酸残基数在350~650之间,相对分子质量为38~70kD;除了BoPIN5和BoPIN8不含中间亲水区以外,其余6个BoPINs家族成员都含有位于两端的疏水区和中间亲水环,它们可能以膜锚定蛋白的形式发挥作用;甘蓝BoPINs与芜菁BrPINs、拟南芥AtPINs基因家族亲缘关系较近;染色体定位分析表明,BoPIN1-1、BoPIN3-1、BoPIN3-2和BoPIN6与S位点之间发生不同程度的连锁;启动子活性分析表明,BoPINs家族蛋白参与甘蓝SI反应,可能受IAA、ABA等激素相互交叉影响;BoPIN1-1、BoPIN1-2、BoPIN2、BoPIN3-1、BoPIN3-2、BoPIN4、BoPIN6、BoPIN7-1和BoPIN7-2在柱头中表达量均较高;数据表达谱和荧光定量分析表明,8个家族成员中的6个BoPINs基因在自花授粉后下调表达;自花授粉后柱头生长素含量降低,与SI反应呈负相关。因此,在甘蓝BoPINs家族的8个成员中有6个BoPINs基因家族成员可能在膜上以负调节方式调控自交不亲和反应。     

玉米ZmCIPK24-2基因在盐胁迫应答中的功能研究

土壤盐化会影响作物正常生长发育,导致农作物减产。植物在长期适应环境的过程中,进化出了相应的耐盐分子机制。钙调磷酸酶B类蛋白(CBL)及CBL互作蛋白激酶(CIPK)参与植物对盐胁迫的响应。本研究鉴定到一个拟南芥AtSOS2的同源基因ZmCIPK24-2,实时荧光定量聚合酶链式反应结果表明ZmCIPK24-2基因在玉米各组织部位广泛表达,其中在花粉表达量最高;ZmCIPK24-2受盐胁迫诱导表达。ZmCIPK24-2能部分互补拟南芥atsos2突变体的盐敏感表型,在高盐浓度下转基因株系比atsos2突变体的存活率显著提高,根长显著增长。亚细胞定位实验表明ZmCIPK24-2定位于细胞质、细胞膜与核膜。利用酵母双杂交实验及LUC互补成像实验发现ZmCIPK24-2与玉米CBLs家族中的ZmCBL1、ZmCBL4、ZmCBL8和ZmCBL9互作。本研究为解析玉米CBL-CIPK信号通路的功能提供了新的实验证据。     

甘蓝锌指蛋白转录因子BoC2H2的克隆、定位与表达分析

C2H2型锌指蛋白是植物中最重要的转录调节子之一, 主要调控植物的生长发育和胁迫应答反应。本研究通过分析自交不亲和甘蓝未授粉, 自花授粉15、30和60 min, 异花授粉15、30和60 min柱头转录组数据, 筛选到一个自花授粉诱导上调表达的C2H2型锌指蛋白基因, 命名为BoC2H2。BoC2H2开放阅读框756 bp, 编码251个氨基酸残基, 蛋白分子量为26.7 kDa, 等电点为4.62, 是一种亲水性蛋白, 不含信号肽和跨膜域, 含有C2H2型锌指蛋白家族高度保守的ZnF_C2H2结构域。BoC2H2起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有光响应、昼夜节律、茉莉酸响应、防御和应激反应等多种顺式作用元件。通过原生质体亚细胞定位和瞬时浸染烟草, 发现BoC2H2蛋白在细胞核和细胞质中表达。BoC2H2在下胚轴、叶片和花中均有表达, 柱头中的表达量随发育时间而变化, 开花当天后表达量降低。荧光定量PCR结果显示, BoC2H2在自花授粉和异花授粉0~60 min的表达量变化趋势与转录组分析结果基本一致。综上所述, 甘蓝BoC2H2属于C2H2型锌指蛋白家族, 可能参与了柱头响应花粉刺激的分子过程, 这有利于揭示BoC2H2在甘蓝自交不亲和过程中的作用机制, 为研究C2H2型转录因子在甘蓝自交不亲和过程中的调控机制提供依据。     

大豆7S球蛋白α'亚基缺失新种质中黄608的分子鉴定

大豆7S球蛋白α'亚基含量与大豆的营养品质和加工特性关系密切。本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot)从中品661的EMS突变库中筛选出α'亚基缺失突变体中黄608。利用中黄608与登科1号创建了一个由210个个体组成的F2分离群体。遗传分析表明,α'亚基缺失由1对隐性单基因控制。利用连锁分析方法将该基因定位于第10染色体标记SSR10-1489与SSR10-1612之间,其中,包括控制α'亚基合成基因Cgy-1(Glyma.10G246300),序列分析发现,中黄608在Cgy-1第1外显子第84个碱基发生单碱基突变(G84→A84),导致氨基酸翻译提前终止。根据新发现的变异位点开发了共显性分子标记,并检测F2个体基因型,结果表明, Cgy-1基因型与α'亚基表型共分离。本研究不仅为大豆优质育种提供了新材料,同时也为分子育种提供了技术支持。     

水稻矮化宽叶突变体osdwl1的生理特性和基因定位

Plant height is one of the important factors affecting rice lodging. The semi-dwarf rice varieties possess high level of lodging resistance, and could reduce yield loss and improve grain quality. Thus, it is very important to study the molecular and physiological mechanism of dwarf formation in rice. In this study, a stable hereditary dwarf and wider-leaf mutant osdwl1 was obtained from ⁶⁰Co γ-radiated indica restore line Zixuan 1, and its morphological and physiological characteristics, cytological observation, genetic analysis and gene mapping were investigated. Under field condition, the mutant osdwl1 exhibited dwarf and wider-leaf after the tillering stage due to shorter length of the parenchyma cells, and its panicle length and all internodes length were significantly shorter compared with wild type plants at mature stage. Paraffin sections and scanning electronic microscopy (SEM) observation revealed that the number of small vascular (SV) bundles and the distance between SVs increased significantly, resulting in wider-leaf blade in osdwl1. Moreover, the number of microhairs on the abaxial and adaxial epidermis were also increased significantly in osdwl1. In addition, starting at the 3-4 leaf seedling stage, yellowing was visible at the upper middle parts of old leaves in osdwl1. Physiological analysis and transmission electron microscopy (TEM) observation indicated that the lamellar structure of chloroplast was distorted and began to collapse in some mesophyll cells, which led to the reduction of total chlorophyll contents, net photosynthetic rate and F_v/F_m ratio of the second and third leaves from top in osdwl1 at the heading stage. Relative to the wild type plants, the soluble protein content, catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities were significantly decreased, which in turn resulting in the accumulation of H₂O₂ and O₂^-, and a steady increase of malondialdehyde (MDA) contents in the mutant leaves. Genetic analysis and gene mapping showed that osdwl1 was controlled by a single recessive nuclear gene, located in a region of 333 kb between SSR marker RM19297 and the InDel marker ID269-2 on the short arm of chromosome 6. The results would further facilitate the cloning and functional analysis of OsDWL1 gene.     

甘蓝型油菜光敏色素互作因子4(BnaPIF4)基因克隆和功能分析

光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, PIF4)是光信号途径关键转录因子, PIF4与BZR互作介导光信号与油菜素内酯信号互作,参与植物光响应。本文在甘蓝型油菜湘油15号中克隆到2个PIF4基因,分别定位于A03号染色体和C03号染色体,命名为BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03,全长编码序列(coding sequence, CDS)、全长mRNA和全长基因分别为1242 bp和1245 bp、1701 bp和1731 bp、2527 bp和2665 bp,各自编码413和414个氨基酸。BnaPIF4_A03具有7个外显子和6个内含子, BnaPIF4_C03具有8个外显子和7个内含子,与测序品种中双11号相比, BnaPIF4_A03基因第1内含子存在单碱基插入突变,第4和第6内含子存在缺失突变,且具有更长的3'-UTR,两基因其他序列在湘油15号和中双11号之间无差别。BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因编码蛋白具有典型的植物bHLH结构域,亚细胞定位于细胞核,是典型的植物PIF4蛋白。多序列比对和进化分析表明, BnaPIF4蛋白与白菜、拟南芥、亚麻芥等PIF4蛋白高度同源。PIF4蛋白进化关系与物种进化关系一致,近缘物种中的PIF4蛋白在进化树中高度聚类,大量植物中可见PIF4蛋白重复且低等植物中分化程度明显低于高等植物中,表明PIF4蛋白是一个晚期进化事件且可能存在功能冗余。酵母杂交实验表明BnaPIF4与BnaBZR蛋白存在互作,但BnaPIF4不能与BnaBZR基因的启动子互作,表明BnaPIF4与BnaBZR在蛋白水平而非转录水平发生互作。湘油15号中BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因表达规律一致,BnaPIF4基因主要表达于油菜茎表皮、未成熟角果和叶中,在花和根中表达较低,且其表达随油菜生育进程逐渐降低。