新城疫病Ｅ4株Ｆ基因的克隆与术核苷酸序列分析

本试验采有ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＤＶ Ｖ４克隆株Ｖ４（Ｈr）的Ｆ基因进行了扩增与克 隆,并以Ｓanger　’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列,推出氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２bp,单一的开放阅读编码５５３个氨基酸的长肽。Ｆ蛋白的疏水构型有３个强疏水区;Ｆ蛋白上共有１２个Ｃys残基位点和５个潜在糖基化位点。同其亲本毒株Ｑueensland相比,核苷酸同源率为９９．３％,氨基酸同源率９８．７％。上述主要功能区的序列     

番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定

纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液,通过ＰＣＲ技术,从病毒ＤＮＡ中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３完整编码基因。将该ＰＣＲ扩增片在ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅡ位点克隆进ｐＵＣ１８质料载体,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３,进一步对该片段进行序列及用ＣＬＯＮＥ软件分析该序列。结果结盟,其与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ３编码基因的克隆。     

四个新城疫病毒强毒株HN基因的同源性分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）四平株、昌黎株、青岛株、Ｆ４８Ｅ８株分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚增殖，蚀斑纯化（３代），生物学特性鉴定及结合基因序列分析，表明ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒，分别提取ＲＮＡ，利用一对特异性引物及ＲＴ－ＰＣＲ方法，一次性扩增出 ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株和 Ｆ４８Ｅ８株的全长 ＨＮ基因，分别将该ＨＮ基因克隆入载体ｐＫＳ（－）并进行测序。序列分析表明，这４个毒株ＨＮ基因核苷酸长度均为１７１３ｂｐ，编码５７１个氨基酸，其中四平株和 Ｆ４８Ｅ８株含有５个糖基化位点，青岛株和昌黎株含有 ６个糖基化位点，四平株含有 １２个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和Ｆ４８Ｅ８株含有１３个半胱氨酸残基。３个野生毒株与Ｆ４８Ｅ８相比较，核苷酸序列同源性为８５．７％－９９．３％，推导的氨基酸序列同源性为 ８９．５％－９８．８％，其中 ＮＤＶ四平株与标准强毒 Ｆ４８Ｅ８同源关系最近，核苷酸同源性为 ９９．３％，推导的氨基酸同源性为 ９８． ８％。     

鸡痘 病毒282Ｅ4株基因组3.6kb BamHI片段序列测定与分析

本实验将我国ＦＰＶ２８２Ｅ４株片段利用ＤＮＡ测序仪进行了序列测定。经ＤＮＡＳＩＳＶ３．０分析,该片段Ａ＋Ｔ含量为６０．７７％,内含有８个主要的ＯＲＦs。用ＧoldkeyＶ３．０软件比较了ＶＶＰ７．５早期４启动子,ＦＰＶ４b晚期启动子．Ｌ２Ｒ早/晚期启动子和一个早/晚期启动子与各个ＯＲＦ上游１００bp区域的同源性,没有发现有意义的 同源序列;该片段的核苷酸序列和每个ＯＲＦ所编码的氨基酸序列在ＥＭＢＬ核酸序列库和     

新城疫病毒昌黎株与国外毒株HN蛋白基因核苷酸及氨基酸差异性 …

参考国外发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）的ＨＮ基因序列设计了１对特异性引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ对ＮＤＶ昌黎株（野毒）的ＨＮ基因进行了扩增，扩增产物克隆后测序。扩增出的ＨＮ基因核苷酸长度为１ ７４２ｂｐ，编码５７１个氨基酸，序列中有６个糖基化位点，１３个半胱氨酸残基，与国外发表的强毒株序列相符。核苷酸同源怀在８８．５％～９２．９％，推导的氨基酸序列同源性在９０．０％～９４．２％之间。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究

根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段。除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｄ，Ｏｏｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株（ＣＤＶ－ＯＮ）、海豹瘟热病毒２型（ＰＤＶ２）、１型（ＰＤＶ１）在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，分别为９８．１％和９５．５％、９６．２％和９３．２％和     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA原克隆和序列分析

对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒Ｈａｒｂｉｎ毒株的Ａ节段编码序列ｃＤＮＡ基因进行了核苷酸序列分析。结果，克隆的Ａ节段基因共３１０ｂｐ，包括两个完整的阅读框架ＯＲＦＡ１和ＯＲＦＡ２分别编码１０１２氨基酸的前体蛋白ＶＰ２－４－３和１４５氨基酸的ＶＰ５，两者有部分重叠。     

鸡新城疫病毒B95株融合蛋白基因的克隆与序列分析

以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）澳大利亚布里斯班分离株Ｒ９５的 ＲＮＡ为模板,运用的ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增其融合蛋白（Ｆ０）基因的ｃＤＮＡ。将扩增的Ｆ基因克隆到质粒ＰＵＣ１９中,转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＡＩＸ平板筛选,ＰＣＲ等方法鉴定出Ｆ基因的阳性重组质粒,同时测定了Ｆ基因５’端７０９个核苷酸及３’端７６８个核苷酸的序列,对相应的氨基酸序列的研究表明,Ｂ９５株属弱毒株,含有Ｆ０中保守的疏水功能区和可糖基化位点,Ｂ９５与强毒株Ｆ４８Ｅ８株、Ｍｉｙａｄｅｒａ株和中等毒力的Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｃ株的氨基酸序列的同源性在９０％左右。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

一株鹅细小病毒全基因特征分析

根据GenBank登录的鹅细小病毒基因序列和基因组结构特征,采用PCR技术扩增获得一株鹅细小病毒株（Goose parvovirus,GoPV）全基因序列,为中国大陆地区首次报道。GoPV株病毒全基因大小为5106nt,其基因组5’端和3’端均含有相同的末端倒置重复序列（inverted terminal repeats, ITR）,ITR全长为444nt。GoPV基因组主要由左右两侧两个开放阅读框组成,左侧编码非结构蛋白（non-structureprotein,NS）NSl和NS2,右侧编码3种结构蛋白（viral structural protein,VP）VP1、VP2和VP3。NS基因全长为1884nt（537-2420nt）,其中NS2全长1356nt（1065～2420nt）;VP基因全长2199nt（2439-4637nt）,其中Ⅵ叼全长1764nt（2874-4637nt）,VP3全长1605nt（3033-4637nt）,在其右侧的ITR前有一个Poly（A）的尾。GoPV株病毒全基因和欧洲疫苗株（EU583392（VG32／1,Europe））核苷酸同源性最高,高达98．6％。本研究为进一步研究GPV分类地位以及进化关系提供依据,也为研究GPV强毒株和疫苗株之间生物学特性以及GPV治病机理和开发基因工程疫苗奠定基础。     

Phylogenetic similarity of the canine parvovirus wild-type isolates on the basis of VP1/VP2 gene fragment sequence analysis

Biological material was taken from dogs with diarrhoea. Faecal samples were taken from within live animals and intestinal tract fragments (i.e. small intestine, and stomach) were taken from dead animals. In total, 18 specimens were investigated from dogs housed alone or in large groups. To test for the presence of the virus, latex (On Site Biotech, Uppsala, Sweden) and direct immunofluorescence tests were performed. At the same time, polymerase chain reaction (PCR) with primers complementary to a conservative region of VP1/VP2 was carried out. The products of amplification were analysed on 2% agarose gel. The purified products were cloned with the Template Generation System (Finnzymes, Espoo, Finland) using a transposition reaction and positive clones were searched using the 'colony screening by PCR' method. The sequencing gave 12 sequences of VP1/VP2 gene fragments that were of high similarity. Among the 12 analysed sequences, six exhibited 88% similarity, four exhibited 100% similarity and two exhibited 71% similarity.     

强毒小肠结肠耶氏菌生物素标记基因探针的研究

在构建的小肠结肠耶氏菌毒性质粒DNA基因文库pYB1～8与pYP1～6的基础上,筛选出了pYB7和pYP6克隆株.用限制性内切酶Bam HI消化pYB7,Pst消化pYP6,可分离出3.8kb和6.4kb的插入性DNA片段.以这两个基因片段为目的基因,用生物素化dUTP和光敏生物素标记,获得了生物素标记的基因探针.该探针能检出10pg以上的强毒小肠结肠耶氏菌DNA,不与无毒小肠结肠耶氏菌及大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等18种对照菌反应,具有高度的特异性和敏感性.pYB7与pYP6探针对不同血清型及来源的小肠结肠耶氏菌检测,其结果与自凝性试验、依钙试验等结果相符;对小肠结肠耶氏菌强毒株与无毒株检定的准确率为100%.     

Phylogenetic Similarity of the Canine Parvovirus Wild‐Type Isolates on the Basis of VP1/VP2 Gene Fragment Sequence Analysis

Biological material was taken from dogs with diarrhoea. Faecal samples were taken from within live animals and intestinal tract fragments (i.e. small intestine, and stomach) were taken from dead animals. In total, 18 specimens were investigated from dogs housed alone or in large groups. To test for the presence of the virus, latex (On Site Biotech, Uppsala, Sweden) and direct immunofluorescence tests were performed. At the same time, polymerase chain reaction (PCR) with primers complementary to a conservative region of VP1/VP2 was carried out. The products of amplification were analysed on 2% agarose gel. The purified products were cloned with the Template Generation System (Finnzymes, Espoo, Finland) using a transposition reaction and positive clones were searched using the `colony screening by PCR' method. The sequencing gave 12 sequences of VP1/VP2 gene fragments that were of high similarity. Among the 12 analysed sequences, six exhibited 88% similarity, four exhibited 100% similarity and two exhibited 71% similarity.     

禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株衣壳蛋白基因原核表达及其ELISA检测研究

利用RT PCR方法扩增了禽脑脊髓炎病毒VP0、VP3和VP1基因 ,分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,转化到E .coliER2 566表达菌内 ,经IPTG诱导表达后 ,SDS PAGE分析表达产物。结果表明 ,表达的VP0、VP3、VP1融合蛋白分子量分别为 53 ,53 ,56ku。以电洗脱法纯化VP0、VP3、VP1表达蛋白抗原并分别建立了间接ELISA方法 ,用阳性血清和阴性血清进行检测。结果显示 ,表达VP1蛋白反应活性相对高于VP0、VP3蛋白反应活性 ,最后再将自制VP1板用自配试剂检测其活性 ,同时用美国试剂盒检测VP1活性 ,美国ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样 1 0份血清作比较 ,三组ELISA检测结果 ,其中有 8份被检血清为阳性 ;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明VP1表达蛋白活性达到预期要求 ,可以用做AE的ELISA诊断     

多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点，设计合成了二对引物XZ1，XZ2和XZ45、XZ46，建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明，用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR，强毒株只扩增出732bp一条带，而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带，而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带，结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础.     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定

根据GenBank中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计合成两对特异性引物1F/1R和2F/2R,从疑似CPV感染病犬的粪便病料中提取DNA作为模板,分段扩增涵盖VP2基因的两个片段,大小分别为1325和758 bp,并进行克隆、测序,通过拼接得到11条长度为1755 bp的VP2基因完整序列。核苷酸同源性分析表明,扩增得到的11个完整VP2基因序列与GenBank中发布的21株国内外参考毒株比较,核苷酸同源性为96.2%~99.8%。采用DNAStar软件分析,预测VP2蛋白可能成为B细胞表位的区段位于Met1-Val38、Met73-Val82、Met96-Ala103、Lys151-Thr170、Gly235-Phe243、Leu294-Phe303、Ala359-Thr399、Ile469-His483、Ala503-Arg520、Lys570-Tyr584。将扩增获得的VP2基因编码的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较,第426位和第555位氨基酸残基分别为Asp和Val,鉴定出本试验得到的CPV基因型均为2a型,初步证实成都地区仍以CPV-2a为主要流行毒株。