SYBR Green荧光RT-PCR法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒(CDV)H蛋白基因的保守序列设计了1对引物,经过各反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了CDV的SYBR GreenⅠRT-PCR荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,建立的方法特异性较好,几种非CDV病原体检测均为阴性;敏感性实验表明其敏感性可达1个TCID50,高于普通RT-PCR和胶体金检测试剂盒;重复性试验表明所建立的检测方法非常稳定;临床检测中,在39份样品中检测到28份阳性样品,高于普通RT-PCR方法的检出率。该方法检测成本低、特异性强、敏感性高、重复性好,可推广应用于毛皮动物CDV的大规模高通量的检测。     

犬瘟热病毒一步RT-PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核蛋白(N)基因的相对保守区序列设计了1对特异性寡聚核苷酸引物,在国内首次建立了CDV一步RT-PCR检测方法。该法可以特异地扩增出N基因265 bp大小的目的片段,可以检测到0.043 6μg/mL的总RNA,与两步法RT-PCR的敏感性相当。对25例犬瘟热临床疑似病例样品,一步法RT-PCR检测出17份阳性,与两步法RT-PCR的阳性符合率达94.4%,胶体金检测试纸条检测出13份阳性。研究结果表明,建立的CDV一步法RT-PCR检测方便、敏感、特异,适用于CDV临床病料的检测和分子流行病学调查。     

荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测

为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段.     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用

犬瘟热(CD)发病率近年来在我国呈明显上升趋势,对早期CD诊断方法的发展和完善,有利于指导临床及时治疗,对于控制CD的蔓延有重要意义.根据GenBank中CDV核衣壳蛋白(N)基因序列,设计合成一对特异性寡聚核苷酸引物,提取CDV疫苗株的总RNA进行反转录和PCR,建立RT-PCR检测方法,并应用于临床病例的诊断,同时和CDV抗原快速诊断试纸进行比较.结果显示:RT-PCR有很好的敏感性和特异性,适合对CDV进行早期快速诊断和流行病学调查.     

犬瘟热病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立犬瘟热病毒(CDV)的一步法RT-PCR检测方法,并将其应用于临床实践检测。本研究根据GenBank上已登录的CDV基因序列,设计一对特异性引物,建立CDV一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CDV感染的早期诊断和病原监测。     

犬瘟热病毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成2对通用引物和1条通用探针,通过体外转录构建绝对定量标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立CDV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达4.02拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍,具有良好的重复性。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。研究结果表明,建立的CDV荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为犬瘟热的早期诊断提供了重要的技术支撑。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列,设计特异性引物,建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法敏感性比普通RT-PCR高出100倍,重复性良好,变异系数在1.01%以下,对犬的常见病原核酸提取物检测均为阴性,证明特异性良好。对32份临床样本进行检测,27份为阳性,高于普通RT-PCR方法。试验结果表明该方法可用于犬瘟热感染情况的检测。     

RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒H基因核苷酸序列 ,设计合成一对引物对贵州临床诊断为犬瘟热 (CD)病死犬的心、肝、脾、肾、粪便进行RT PCR检测。结果表明 :从心、脾、肾病料上清液中可扩增出 760bp的特异性带 ,与预期扩增片段长度相同 ;粪便和肝脏上清液RT PCR结果为阴性 ,但粪便上清液接种Vero细胞后连续传代 3代 ,每代细胞培养液RT PCR结果均为阳性 ;在检测的 2 2条病死犬中 ,有 1 9条病死犬检测到犬瘟热病毒H基因的特异性核酸片段 ,阳性率为 86 4% (1 9/ 2 2 )。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献,选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明,该方法重复性良好;检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝;对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性;对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR,检出127份阳性样品,其中强毒株98份,弱毒疫苗株29份,常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明,该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测,并能有效的鉴别强弱毒株。     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

犬瘟热病毒快速检测技术研究进展

犬瘟热病毒感染犬、狼、貂、狐等多种动物,发病率、死亡率较高,造成严重危害.因此,快速准确检测该病并及时治疗是防控的有效措施.本文综述了几种犬瘟热病毒的快速检测技术,包括免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析技术、核酸杂交技术、聚合酶链式反应和环介导等温扩增技术.并对犬瘟热病毒快速检测技术进行了评述,为犬瘟热的临床快速准确诊断提供参考,对该病的防治具有重要意义.     

鹅圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的GoCV全长基因组序列,在其保守基因区设计并合成1对引物,采用荧光嵌合法(SYBR GreenⅠ)建立检测GoCV的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法。以本实验室构建的含有GoCV永康株(GoCV-yk01)全长基因组的重组质粒为标准模板,经退火温度、循环次数等反应条件的优化,绘制GoCV real-time PCR的标准曲线,并进行融解曲线分析。试验结果表明:建立的GoCV real-time PCR方法特异性强,检测范围广(Ct值范围12～32),最低检出病毒拷贝数为1.46×102。该方法能够对组织中病毒进行定量检测,为快速检测GoCV提供了有效的技术手段。     

用半套式PCR检测犬瘟热病毒的研究

根据ＧｅｎＢａｎＫ中Ｂａｒｒｅｔｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列,设计合成了能扩增７６０ｂｐ基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍－－酚－－仿一步抽取法提取细胞总ＲＡＮ进行反转录,再以此产物进行半套式ＰＣＲ扩增,并筛选出最佳ＰＣＲ扩增。结果经半套式ＰＣＲ扩增能得到与设计片段大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验     

犬瘟热病毒的检测技术

从免疫学和分子生物学两方面对犬瘟热病毒检测技术进行了综述 ,并探讨了今后的研究方向。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒（CDV）弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白（NP）基因序列设计了套式引物，建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明，该法可以特异扩增出CDV NP基因片段，但从RNA病毒狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬冠状病毒（CCV），DNA病毒犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明，RT-PCR可以扩增10^-6稀释度的病毒RNA，而建立的RT-nested PCR可以扩增到10。稀释度的病毒RNA，后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例，检出率达90％，明显高于RT-PCR的检出率（45％）。部分病例扩增片段的测序结果表明，CDVNP基因出现个别碱基变异。研究结果表明，建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异，适用于动物犬瘟热的快速诊断。