牛奶中庆大霉素胶体金试纸条检测方法的研究

采用胶体金免疫层析法检测牛奶中庆大霉素残留。制备得到了庆大霉素半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,用免疫原制备特异性单克隆抗体,建立了一种简单、快速和高通量的检测牛奶中庆大霉素残留量的胶体金免疫层析法。试纸条对牛奶样品的检测限为20μg/L,假阳性率为0,假阴性率为0,重复性较好,牛奶样品可直接检测,检测时间只需5min,适合在基层抽检、乳品企业质控、原料奶站现场大量筛查使用。     

克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制

本试验旨在研制同时检测克伦特罗(CL)和莱克多巴胺(RAC)的多残留胶体金免疫层析试纸条(Multistrip).用细胞融合技术筛选CL和RAC杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,金标抗体竞争性膜层析技术研制Multistrip.该试纸条由样品垫、偶联垫、双检测线和质控线标记的NC膜、吸收垫等几部分构成,其中偶联垫上灌注有CL和RAC两种金标单克隆抗体,双检测线由检测抗原CL-OVA和RAC-BSA喷膜构成,间距2 mm.结果表明:多残留试纸条的CL和RAC目测检测限分别为1和2 ng·mL-1,检测时间5～8 min.基质呈阳性的真实样品用单残留试纸条、ELISA和GC-MS检测,结果一致,无假阳性或假阴性案例.该试纸条具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于现场检测和筛选.     

酶联免疫吸附法测定牛奶中庆大霉素的残留量

本文采用ELISA检测试剂盒,测定牛奶中庆大霉素的残留量,牛奶样本经离心后,取上清液,采用间接竞争ELISA方法,在酶标板微孔条上预包被偶联抗原,样本中残留的庆大霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗庆大霉素抗体,加入酶标二抗后,用TMB底物显色,结果表明样本吸光值与残留物庆大霉素的含量成负相关。     

快速检测致病性副溶血弧菌的Dot-ELISA方法的建立

本研究选用硝酸纤维素膜作固相载体,以出现明显清晰斑点者判为阳性结果,成功建立了检测致病性副溶血弧菌耐热直接溶血素(direct heat hemolysin,TDH)的斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)方法。根据棋盘试验,确定免疫血清最佳工作浓度为1:100,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000。特异性检测结果表明,TDH阳性的副溶血弧菌可以呈现明显清晰斑点,而不能产生TDH的副溶血弧菌及其他对照菌(如嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)均无斑点显示。该方法与PCR方法的符合率为82.5%。本研究所建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速,特异性和敏感性较高,适合基层和现场的初步筛选。     

应用Dot-ELISA检测结核病牛血清抗体效价

用牛型结核菌菌体蛋白(PP)及提纯牛结核菌素(PPD)作抗原,硝酸纤维素滤膜(NC 膜)作载体。以斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测了30份结核菌素变态反应阳性牛及30份非结核病牛血清中的抗体效价。结果证实,Dot-ELISA 与变态反应符合率很高(20/30),只有简便、快速、经济及适于现场推广应用等优点,可望在今后牛结核病检疫中取代变态反应和常规 ELISA.     

犬DEA1.1血型抗体间接Dot-ELISA检测方法建立

为了建立一个更为简单和敏感的方法,以作为不使用试剂红细胞检测犬DEA1.1血型抗体的替代方法,从犬DEA1.1阳性红细胞中分离出细胞膜。将携带DEA1.1阳性抗原的膜置于硝酸纤维素膜上,加入初级抗体和辣根过氧化物酶标记的二级抗体,采用TMB显色试剂盒检测。对照试验采用凝聚胺抗球蛋白试验检测DEA1.1抗体。用DEA1.1阳性和阴性血型抗原检测Dot-ELISA的灵敏度、稳定性和特异性。用158只犬的血清样本检测Dot-ELISA的准确性。结果显示,Dot-ELISA方法比凝聚胺抗球蛋白试验灵敏8倍以上。即使细胞膜反复冻融20次,其抗原稳定性也不受影响,并且可在-20℃时长期稳定保存。在对158只犬血清检测的过程中,该方法展现了与凝聚胺抗球蛋白试验较高的相关性。表明本研究成功建立了犬DEA1.1血型抗体Dot-ELISA检测方法,并且方法稳定、灵敏、无需试剂红细胞,可以作为输血前传统抗体检测的一种有效替代方法。     

动物尿液中沙丁胺醇残留检测试纸条的研制

为了制备可用于检测动物尿液中沙丁胺醇(SAL)残留的试纸条,试验采用胶体金免疫层析方法,首先将小分子SAL进行改造,并在此基础上制备SAL抗原和抗SAL抗体,进而制备得到胶体金标记抗体,然后将其喷涂于胶体金结合垫,并与样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸及塑料底板组装,得到SAL检测试纸条。结果表明:试纸条对猪尿、牛尿、羊尿中SAL的检测限为3.0μg/L,检测时间为5 min,特异性高,重复性良好,与仪器检测方法结果一致,可用于动物尿液中SAL的现场快速检测和筛选工作。     

鸽Ⅰ型副黏病毒免疫胶体金诊断试纸条的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,胶体金用抗鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)F蛋白单克隆抗体标记并纯化,包被于玻璃纤维膜。再将纯化的抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的二抗包被在NC膜作为检测线和质控线,组装成PPMV-1快速检测试纸条,建立一种快速、简便的检测PPMV-1的胶体金免疫层析方法。结果表明,所研制PPMV-1胶体金免疫层析快速检测试纸条,准确性高,且不与鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、鸡马立克病毒等发生交叉反应;批间和批内的重复性较好;灵敏度高,试纸条可以检测血凝效价≥23的病毒液;试纸条置4℃避光密封干燥保存1年,37℃放置10 d,对其性能没有任何影响。试纸条与HA、HI试验检测方法相比,检测棉拭子的符合率为97.5%,检测病料的符合率为100%。所研制的PPMV-1试纸条在鸽Ⅰ型副黏病毒检测诊断方面具有快速、灵敏、特异、简便等特点,具有良好的开发应用前景。     

胶体金试纸条半定量检测鸡蛋中磺胺嘧啶残留

采用竞争反应模式建立了鸡蛋中磺胺嘧啶(SD)残留的胶体金试纸条半定量检测方法。该试纸条由吸样材料、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水材料组成。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,胶体金标记SD单克隆抗体;SD竞争物包被于硝酸纤维素膜,制成胶体金试纸条。该试纸条在15min内可完成对SD残留的半定量检测,读条系统判定灵敏度为5μg/L,肉眼判定检测限为10μg/L,与其他磺胺类药物无交叉反应,在鸡蛋中的回收率为71%~96.7%;用试纸条与ELISA对来自动物试验的52份鸡蛋样品进行对比检测,以10、100ng/g为cutoff值,两者阳性(大于100ng/g)符合率为100%,弱阳性(10~100ng/g)符合率为72.7%,阴性(小于10ng/g)符合率为84.2%,两者总符合率为94.2%。该方法灵敏度高,简便快速,无需特殊仪器设备,有良好的开发应用前景。     

猪传染性胃肠炎病毒血清抗体Dot-ELISA检测方法的建立

为快速检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体,本研究以原核表达系统串联表达的含有TGEV S蛋白抗原表位C的重组蛋白r-(C_1C_2)6为包被抗原建立TGEV血清抗体的Dot-ELISA检测方法。经反应条件优化结果显示,抗原最适包被量为62.5 ng/点;血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶80和45 min;羊抗猪IgG-HRP最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min;最适封闭条件分别为5%脱脂乳37℃,45 min;血清和酶标抗体最适反应温度均为37℃;最佳显色时间7.5 min。结果显示该方法与猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。该方法对TGEV阳性血清最低检测限为1∶1 280。采用建立的Dot-ELISA对27份临床猪血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA与TGEV/PRCV抗体检测试剂盒检测结果的符合率为92.6%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异,适合用于TGE快速诊断。     

呕吐毒素残留快速检测试纸条的研制

为研制一种用于检测牛奶中呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）残留的快速检测试纸条,试验以人工合成抗原DON-OVA和羊抗鼠二抗为原料,包被硝酸纤维素膜;以抗DON单克隆抗体为原料,制备金标抗体,并冻干保存于反应板微孔中,最终制备出可用于检测牛奶中DON残留的胶体金快速检测试纸条。结果显示,该检测试纸条检测限为100 μg/L,重复性、特异性均较好,可用于检测牛奶中DON残留。     

酪蛋白胶体金快速检测卡的研制

目的:制备检测乳制品中酪蛋白含量的胶体金快速检测卡.方法:以酪蛋白为抗原和抗酪蛋白多克隆抗体为原料,用硝酸纤维膜和玻璃纤维纸作为载体,制作出检测酪蛋白胶体金快速检测卡.结果:该检测卡检测酪蛋白的灵敏度可达到2.3mg/mL,检测时间10min,重复性和稳定性良好.结论:本实验成功制作出了能检测酪蛋白的快速检测卡.     

新城疫病毒胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速检测新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记NDV单克隆抗体6C4制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好1条病毒检测线（T线）和1条羊抗鼠抗体质控线（C线）,制备免疫层析检测试纸条,使用该制备好的检测试纸条可在10 min内检测出新城疫病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍,与禽流感病毒未出现交叉反应,用缓冲液对照测试,结果为阴性,在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。本研究建立的NDV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。     

Comparison of the dot-immunobinding assay with the serum agglutination test, the rose bengal plate test and the milk ring test for the detection of Brucella antibodies in bovine sera and milk.

In this study, Brucella antibodies in bovine sera and milk were detected using the dot-immunobinding assay (DIA), the serum agglutination test (SAT), the Rose Bengal plate test (RBPT) and the milk ring test (MRT). For this purpose, a total of 116 paired blood and milk samples collected at the same time from 56 aborted and from 60 healthy dairy cows was examined. In DIA, a nitrocellulose membrane (NCM) was used as the solid phase. Antigen adsorbed on the NCM was extracted from Brucella abortus S99 by heat treatment. The results obtained by DIA were compared with those of SAT, RBPT and MRT. Of the 116 paired blood and milk samples, 24 were positive and 72 were negative by all tests used. Serum samples of six aborted cows were positive by DIA, SAT and RBPT but the milk samples were negative by DIA and MRT. Serum and milk samples of four aborted cows gave positive reaction only by DIA tests. The remaining six aborted cows were negative only by MRT and two of them were negative by both RBPT and MRT. Four sera of healthy cows were found to be positive only by SAT.     

新城疫病毒和禽流感病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速而且能同时检测新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,分别标记NDV单克隆抗体6C4和AIV单克隆抗体制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗鼠抗体质控线(C线),制备复合型免疫层析检测试纸条。结果在10 min内,可同时检测出两种病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍;AIV重组抗原的检测灵敏度为1.7μg/mL。两种病毒互相测试,未出现交叉反应。用缓冲液对照测试结果为阴性。在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。说明本研究建立的NDV和AIV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。     

旋毛虫53kuES重组蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制

为建立一种简易、快速检测动物血清中的旋毛虫排泄分泌(Excretory-secretory,ES)抗原的胶体金免疫层析试纸法,本研究选用旋毛虫53 ku ES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(MAb).利用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法纯化MAb及兔抗旋毛虫53 ku ES多克隆抗体,利用枸橼酸三钠还原法制备的胶体金颗粒标记MAb,制备免疫金标试纸条.结果表明,获得的2株IgG1型杂交瘤细胞系4D10和5A2能够稳定分泌抗体,且效价高;胶体金标记MAb 4D10所制备的试纸条具有重复性好、灵敏性和特异性高的优点;该试纸条4℃条件下可密封保存6个月以上.     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。     

Recent applications of the Dot-ELISA in immunoparasitology

The dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) is a highly versatile solid-phase immunoassay for antibody or antigen detection. The assay uses minute amounts of reagent dotted onto solid surfaces such as nitrocellulose and other paper membranes which avidly bind proteins. After incubation with antigen-specific antibody and enzyme-conjugated anti-antibody, the addition of a precipitable, chromogenic substrate causes the formation of a colored dot on the solid phase which is visually read. The Dot-ELISA has been used extensively in the detection of human and veterinary protozoan and metazoan parasitic diseases, including amebiasis, babesiosis, fascioliasis, cutaneous and visceral leishmaniasis, cysticercosis, echinococcosis, malaria, schistosomiasis, toxocariasis, toxoplasmosis, trichinosis, trypanosomiasis and even ixodid tick infestation. The technique is rapid, easy to perform and interpret, reagent conservative, cost effective and field portable. In addition, the Dot-ELISA may be configured to detect antibodies or parasite antigen in either microtiter plates for large-batch testing or with dipsticks for small numbers of determinations. A slight modification of the Dot-ELISA procedure allows the determination of infection rates of vectors such as ticks and sandflies with parasites.     

Development and evaluation of an immunochromatographic strip for trichinellosis detection

In the present study, an immunochromatographic strip was developed for the serological detection of trichinellosis in swine. In the strip, the excretory-secretory (ES) antigens of Trichinella labelled with colloidal gold was used as the detector, and the staphylococcal protein A (SPA) and goat anti-ES antibody were blotted on the nitrocellulose membrane for the test and control lines, respectively. The evaluation of the strip was performed by comparing 60 clinical positive blood samples detected by the artificial digestion method with 46 serum samples from pigs infected with parasites other than Trichinella and 30 serum samples of parasite-free healthy pigs. The strip was shown to be of high specificity and sensitivity that were closely correlated with those of ELISA. Furthermore, the dipstick assay based on the strip is rapid (10 min) and easy to perform with no requirement of special skill, reagent or equipment. This suggests the immunochromatographic strip is an acceptable alternative to be used in clinical laboratories lacking specialized equipment as well as for field diagnosis.     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。