猪细小病毒主要非结构蛋白与结构蛋白的密码子偏爱性分析

通过分析猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）主要非结构蛋白（non-structural protein,NS1）及结构蛋白（VP1、VP2）的密码子偏爱性,为三种蛋白基因表达中宿主系统的选择提供参考。运用EMBOSS（The European Molecular Biology Open Software Suite）的CHIPS（Codon Heterozygosity in a Protein Coding Sequence）和CUSP（Create a codon usage table）程序对PPV的NS1、VP1和VP2蛋白基因进行分析,并将分析结果与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较。结果显示,PPV的NS1、VP1、VP2基因的Nc（Effective number of codons）值分别为39．696、36．638和36．482,表明三种蛋白存在较明显的密码子偏爱性,并且均偏爱选择第三位核苷酸为A的密码子。PPV三种蛋白与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性也有一定差异,其中与酵母的密码子偏爱性差异最小,其表达系统选择酵母较为合适。     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

3种大蒜中洋葱黄矮病毒的RT-PCR分子鉴定

洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus,OYDV）是危害大蒜产量和品质的主要病毒之一。快速有效的病毒检测方法可为大蒜病毒病的研究和有效防御提供理论与技术资料。本研究利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中OYDV外壳蛋白基因进行特异性扩增,并克隆到载体PMD18-TEasy Vector上进行核苷酸序列测定及分析。成功分离得到OYDV的两个DNA片段——GSCCS和SDLSW2,与GenBank中已报道的AB000837.1、AB000838.1和AJ409311.1等22个OYDV DNA片段的核苷酸相似性分别为81%～98%和81%～84%,氨基酸相似性分别为85%～99%和89%～94%,二者之间核苷酸相似性为84%,氨基酸相似性为89%。系统进化树显示不同DNA片段可聚为3个组群,GSCCS与中国山东金乡OYDV DNA片段同属一组,SDLSW2与其它16个OYDV DNA片段同属一组,表明OYDV在甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中均存在,但具有一定差异。本实验确定了OYDV的基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。     

2个猪品种的背最长肌组织中兰尼定受体（RYR1）基因表达的发育性变化

本研究采用实时荧光定量PCR方法检测了长白猪和梅山猪背最长肌组织中RYR1基因mRNA表达量在初生（0月龄）、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄和5月龄间的变化及其与体重、肌纤维面积（CSA）和肌内脂肪含量（IMF）之间的相关性。结果表明：长白猪的体重、CSA在多数月龄均高于梅山猪,而梅山猪的IMF在多数月龄均高于长白猪。两品种RYR1基因表达量的发育性表达模式极为相似,均表现为波动起伏中逐渐上升的趋势。相同月龄时,梅山猪RYR1基因的表达量均高于长白猪。本文初步揭示了两猪种生长发育过程中RYR1基因表达的发育性变化模式和品种差异,为进一步研究RYR1基因对猪肉质性状的影响提供了基础数据。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位

猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。     

鸡传染性喉气管炎的研究 Ⅰ．应用间接ELISA法检测鸡传染性喉气管炎病毒抗体

采用原代鸡胚肾（ＣＥＫ）细胞增殖鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ），并用ＰＥＧ－２００００粗提病毒蛋白抗原，建立了用来检测抗ＩＬＴＶ抗体的间接酶联免疫吸附试验。应用该法检测从广西９个大、中型鸡场采集的２３９份未免疫鸡血清样品，结果血清样品阳性率为４５．１９％，各个鸡场均为阳性场（１００％），首次证实广西存在ＴＬＴＶ抗体阳性鸡群．     

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LSD/05 Ⅰ的分离、鉴定及弱毒疫苗对气管的保护

从2005~2006年中国部分地区鸡场疑似鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)感染鸡分离到12株鸡传染性支气管炎病毒,并对其部分生物学特性及基因型进行了研究。发现其中11株病毒分属于LX4和CK/CH/LSC/99Ⅰ型。通过S1基因比较、进化树分析、BLAST搜寻和动物试验研究发现,CK/CH/LSD/05Ⅰ是一株新型变异毒株。动物感染试验表明,CK/CH/LSD/05Ⅰ感染鸡的肾脏病变不明显,仅有20%的感染鸡肾脏病毒分离呈阳性,但100%感染鸡呼吸道病毒分离阳性,表明该病毒不是中国普遍流行的肾型毒株,而其对呼吸道具有较强嗜性。同时,实验应用弱毒疫苗H120和本实验室致弱的3株异种毒株进行了动物保护试验,结果显示,用CK/CH/LSD/05Ⅰ攻毒后,这4株异种传染性支气管炎病毒的免疫对气管的保护率很低。初步揭示该毒株可能属新的血清型病毒。     

诱导表达猪生长激素pGH载体系统构建及其在PK15细胞中表达验证

为实现外源生长激素(GH)基因在特定时间、空间的可控表达,本研究构建四环素(TET-ON)表达载体系统,并在细胞水平对该载体系统进行诱导活性验证。结果表明:(1)成功构建了重组载体pTRE-GH12;(2)筛选建立了可诱导表达GH的细胞系;(3)利用强力霉素(doxycycline,DOX)诱导阳性细胞克隆并检测外源GH的表达,QRT-PCR结果表明,实验组细胞在DOX诱导后表达活性是诱导前264.481倍;对照组细胞在DOX诱导前诱导后表达无明显变化,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后差异极显著(P<0.01);(4)Western杂交后灰度分析结果和QRT-PCR趋势一致,实验组和对照组细胞间GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,四环素(TET-ON)诱导猪生长激素(GH)表达系统实现了可控表达,为以后制备可诱导表达GH的转基因动物提供了技术基础。     

胎猪胰腺干细胞的分离与鉴定

从胎猪胰腺分离得到一株细胞，该细胞经免疫组化检测表达PDX-1，GLUT-2，PCNA，Glucagon，somatostatin，polypeptide，弱表达nestin，目前细胞已传至58代。其在体外的生长行为有类似间充质干细胞样生长形态，经诱导后可分化为具有三维立体结构的类胰岛细胞团。成团后细胞强表达insulin、ck-19等标志，放免测定显示诱导成团后细胞胰岛素分泌量增加，显著高于未诱导细胞（P<0.05）。说明胰腺内存在着多潜能干细胞，本方法分离到胎猪胰腺干细胞，经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素,有望为进一步研究异种胰腺干细胞移植治疗糖尿病提供材料。     

山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定

摘要：比较四种原代角膜内皮细胞分离培养方法,并对分离培养的山羊角膜内皮细胞生长特性进行初步研究。取屠宰1～2月龄关中奶山羊角膜,无菌分离角膜内皮层和Descemet’s membrane,分别用组织块法、胰蛋白酶法、dispase法和dispase加胰蛋白酶法分离培养原代角膜内皮细胞,比较这四种方法处理后细胞离散和贴壁情况。结果显示,dispase加胰蛋白酶法为最佳分离纯化角膜内皮细胞的方法。分离的细胞经形态学观察、免疫组化染色、Giemsa染色、扫描电镜和透射电镜等方法鉴定为角膜内皮细胞。说明dispase加胰蛋白酶法为角膜内皮细胞分离培养的理想方法,该方法可为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究和构建组织工程化人工角膜内皮提供种子细胞。     

兔胰腺干/祖细胞的分离培养和鉴定

采取1～9日龄的实验仔兔胰腺,1 mg/mLⅣ型胶原酶消化,低糖DMEM培养.细胞铺满后进行传代20代以上冻存.对2～3代的细胞进行免疫组化染色,诱导向β细胞分化并进行高糖刺激胰岛素分泌.结果表明,兔的胰腺干/祖细胞具有较强的增殖能力;免疫组化染色表现为PDX-1、CK19、nestin和胰高血糖素阳性;分化诱导2 d后,双硫腙染色（DTZ）20%阳性,6 d后迅速增加到80%;高糖刺激诱导细胞具有胰岛素释放能力.通过免疫组化染色和诱导细胞胰岛素分泌实验证明分离的是兔胰腺干/祖细胞.首次报道兔胰腺干/祖细胞分离培养方法.     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

人源羊水干细胞的培养、鉴定及影响因素分析

取人羊水标本进行羊水干细胞原代,分离培养,并探讨人羊水标本性状等因素对原代分离培养的影响.结果表明,分离的羊水干细胞表达Oct-4等胚胎干细胞和CD29等成体干细胞的特异基因,细胞生长迅速,增殖能力较强,并可分化为Nestin阳性的神经细胞和α-actia阳性的心肌细胞.同时,在羊水干细胞原代培养时,羊水标本性状在一定程度上影响细胞的贴壁数量及贴壁时间.羊水标本细胞的贴壁时间孕中期(4.7±0.6)d与孕晚期(6±0.5)d有明显差异(P<0.05),孕晚期贴壁时间较长.羊水中血液污染程度对贴壁时间有明显影响,重度污染组(10.8±0.3)d与无污染组(6±0.5)d、轻度污染组(6.3±0.6)d贴壁时间差异均显著(P<0.05).羊水体积对原代细胞的贴壁数量和细胞贴壁时间有一定影响,羊水体积增大贴壁时间延长,但差异不显著,而贴壁细胞数量随羊水体积增加而增加,各组之间差异显著(P<0.05).实验系统地检测了羊水干细胞原代培养的影响因素,为羊水干细胞研究提供了可以借鉴的资料,同时分离得到的羊水干细胞,具有分化为神经细胞和心肌细胞的潜能,有望作为种子细胞进行临床应用.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性的初步鉴定

利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因分段（A和B段）克隆到pGEX—6p-1载体中，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示有明显的融合蛋白表达条带。通过IBV特异性抗体的Western blot检测，两段表达产物均能与抗体发生特异性反应，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出A段和B段的GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔。连续免疫3次，将得到的抗体与200 TOCID50（气管环半数感染）/0．1mL病毒工作液在37℃温育1h进行TOC试验。经计算A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50％血清中和终点为1：53，表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，B段表达产物更具有良好的抗原性，适合作为免疫抗原和诊断抗原，具有一定的临床应用价值。     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

Biosurfactant in Membrane Separation of Atrazine from Water

This study examines the effects of land use change on nitrate concentration and the abundances of ammonia-oxidizing archaea (AOA), ammonia-oxidizing bacteria (AOB), and narG-containing denitrifiers in shallow groundwater. The results reveal a general increase of nitrate in shallow groundwater following the change of land use from paddy fields to vegetable patches. Furthermore, a significant relationship between NO₃ ^?-N concentrations was observed both in groundwater and in soil at soil depths of 0–20, 20–40, 40–60, 60–80, and 80–100 cm. With regard to gene abundance in groundwater, the AOB amoA gene was most abundant and the AOA amoA gene copy numbers were lowest from the field with long-term paddy cultivation compared with the field under vegetable cultivation. The narG gene copy numbers were higher from the field under short-term vegetable cultivation compared with fields under long-term vegetable cultivation. The NO₃ ^?-N concentrations in groundwater correlated positively with AOA amoA gene copy numbers, negatively with the AOB amoA gene, but with no significant relationship with the narG gene. In conclusion, land use change from paddy fields to vegetable patches increases nitrate in groundwater, which is correlated significantly with nitrate in soil and the abundance of the amoA gene, but is not related to the narG gene in groundwater. This study also suggests that the removal of groundwater nitrate pollution is not feasible through biological denitrification without additional denitrifiers and that it might even become more aggravated because of the AOA.     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Tm22和Mi基因

利用同-PCR反应体系,分别对番茄（Lycopersicon esculentum）抗根结线虫（root-knot nematode）的Mi基因、抗番茄花叶病毒（Tomatomosaic virus）病的Tm2^2基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段基本完全吻合.与Mi基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生750 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq Ⅰ酶切位点,酶切后分别产生了570和200bp以及750、570和200 bp的特异性片段,而感病基因型无酶切位点;与Tm2^2基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生950bp的特异片段,杂合抗病基因型和感病基因型有HindⅢ酶切位点,酶切后除Moperou产生800 bp特异片断外,其余杂合抗病材料均为950、500和280 bp片段.感病材料为500和280bp,纯合抗病基因型无HindⅢ酶切位点,酶切结果仍为950 bp产物.该体系可用于在同-PCR反应体系中对2个抗病基因进行同时筛选鉴定,及苗期早期辅助选育.