几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果

构建了几丁质酶基因植物表达载体,该基因在大肠杆菌中能表达35kD的蛋白质。几丁质酶粗提物在体外对柱花草胶孢炭疽病原菌有极显著的抑菌效果。     

少孢节丛孢菌新疆分离株几丁质酶AO-14基因的克隆表达

利用RT-PCR扩增获得少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-14目的基因片段,对该基因进行克隆和分子特征分析;构建重组表达质粒p ET32a-AO14,转化到大肠杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组蛋白。结果表明,AO-14基因c DNA全长为1 200 bp,编码399个氨基酸;编码蛋白几丁质酶AO-14属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,氨基酸序列的第131~139为活性位点所在区域,无信号肽序列。SDS-PAGE分析结果显示,AO-14表达产物的分子质量约为60 ku;Western-blot分析结果表明,重组蛋白可以与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,证实在大肠杆菌中实现了少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-14基因的表达,为进一步研究少孢节丛孢菌几丁质酶AO-14生物学功能奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因的表达及活性分析

将含有几丁质酶A基因的重组质粒pUC-chiA和载体pBV221分别进行EcoR Ⅰ /BamH Ⅰ双酶切,连接chiA和pBV221构建了表达载体pBV-chiA5.42℃在E.coli BL21中诱导表达,用饱和(NH4)2SO4和几丁质亲和柱层析法纯化了目的蛋白,DNS法和溶圈法分析其活性,表明所得蛋白为活性可溶性几丁质酶.     

家蚕GH18家族几丁质酶的系统进化和BmChi的时期表达分析

昆虫GH18家族几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、细胞增殖和免疫等生理过程。为了系统开展家蚕GH18家族基因的研究,通过多物种几丁质酶的系统进化分析鉴定了8个家蚕GH18家族成员,并根据含有糖苷水解酶18(Glyco_18)催化结构域和几丁质结合结构域的不同将其分为6类,其中,各物种的CHT5具有典型几丁质酶结构。家蚕GH18家族成员中,BmChiR-1具有5个Glyco_18催化结构域和6个几丁质结合结构域,其它7个成员均只有1个Glyco_18催化结构域,BmCHT12还有1个ChitnaseA_N端结构域。8个家蚕GH18家族成员的基因分布在7条染色体上。通过半定量RT-PCR调查家蚕CHT5基因Bm-Chi在家蚕各发育时期的转录表达模式,该基因在蜕皮、化蛹、羽化等发育时期均有高水平表达,推测BmChi在蚕体旧表皮几丁质的降解过程中发挥重要作用。     

柑橘几丁质酶基因家族的结构、分类与进化分析

【目的】植物的几丁质酶与其抗病能力、防御反应和生长发育密切相关,本文通过生物信息学方法来研究柑橘几丁质酶基因家族成员的性质。【方法】通过检索柑橘全基因组序列,发现了32个几丁质酶基因,使用生物信息学软件对这些基因进行分子量、等电点、信号肽、细胞定位、转录谱、保守结构域、系统发育树等方面进行研究。【结果】该家族基因中有26个成员定位在染色体上,其余6个位置尚未确定。这些几丁质酶基因家族成员的蛋白分子量、氨基酸残基和等电点分别位于14.8～72.7KDa、134～636个和4.53～9.21之间。。除3个预测蛋白不含信号肽外,其余均含有信号肽,其中23个蛋白定位在细胞外,6个蛋白横跨细胞膜。对这些基因在花、叶、果实和愈伤等组织的转录组测序数据进行分析,发现它们的转录水平相差巨大,有的在几种组织中转录水平都很高,有的在不同组织中转录水平相差很大,有的在所有组织中表达量都很低。用最大似然法对蛋白序列构建系统发育树,结合保守结构域的分析结果,可将这些几丁质酶基因分为4类。第1类有信号肽且定位在细胞外,有GH18几丁质酶结构域,同时具有糖基水解酶的功能;第2类大部分是带信号肽的跨膜蛋白,也有GH18几丁质酶结构域,还有一个丝氨酸/苏氨酸激酶的结构域;第3类带信号肽且定位在细胞外,有GH19几丁质酶结构域,同时具有溶菌酶的活性;第4类仅有一个基因,是个无信号肽的跨膜蛋白,有GH18几丁质酶结构域,同时具有糖基水解酶的功能,除此之外还含有抗病蛋白中常见的PPR重复结构域。【结论】对柑橘几丁质酶家族进行分析,有助于了解几丁质酶抗病的分子机制,找出起主效抗病作用的几丁质酶基因,从而为提高柑橘的抗病育种提供帮助。     

中华按蚊几丁质酶基因家族的全基因组鉴定与分析

本研究基于生物信息方法对中华按蚊的几丁质酶基因家族进行全基因组鉴定与分析.利用BLAST、HMM及Softberry网站中的基因预测程序进行序列鉴定、检验及补充,筛选出23个中华按蚊几丁质酶基因及类似基因,并进行系统发生分析,将中华按蚊几丁质酶基因分为八大家族,其外显子数为2～13个,跨度较大;基因分布分析结果表明As...     

家蚕微孢子虫几丁质酶基因的比较基因组学分析

几丁质是构成家蚕微孢子虫细胞壁的主要成分,广泛分布于原生生物、真菌、节肢动物和甲壳类生物之中,能够被几丁质酶(EC 3.2.1.14)水解。本文基于家蚕微孢子全基因组数据,采用生物信息学方法,鉴定获得家蚕微孢子虫几丁质酶基因,命名为Nb_chi。该基因有2个拷贝,其中一个Nb_chi_1长度为2 286bp,编码761aa,pI为6.35。含有一个信号肽以及一个Glyco_hydro_19结构域。另一个拷贝Nb_chi_2仅含552bp,183aa,仅含Glyco_hydro_19结构域部分,可能为一不完整的拷贝。系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与其他种类的微孢子虫聚在同一个进化枝,均属几丁质酶第19族。本文为深入进行家蚕微孢子虫几丁质酶的功能研究奠定了基础。     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因AO-587和AO-31的克隆及分子特征分析

为探究新疆捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌几丁质酶的功能,以少孢节丛孢菌XJA1几丁质酶AO-587、AO-31为模板对基因进行扩增、克隆及测序,测序后对该基因及其编码蛋白进行生物信息学和分子特征分析。结果表明,两个几丁质酶均含有几丁质酶催化区保守序列SXGG和VDGXDLDL,都属于糖苷水解酶18家族。AO-587含有信号肽序列,表明此蛋白属于分泌性蛋白;AO-31无信号肽序列。两种几丁质酶的三级结构都具有(α/β)8的圆桶状结构。系统发育分析表明,3个不同的进化分支由分子量差异不同的几丁质酶构成,其中少孢节丛孢菌新疆分离株几丁质酶AO-587和AO-31与Drechslerells stenobrocha亲缘性比较相近,表明它们在侵染线虫的过程中可能发挥着类似的作用。     

哺乳动物几丁质酶的研究进展

几丁质是一种在自然界广泛存在的天然多糖,是许多动物、真菌和微生物的重要组成成分。当含有几丁质成分的病原体进入动物体内,会刺激动物产生几丁质酶来清除病原体。通过动物机体内几丁质酶的生理生化反应将几丁质水解为N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）低聚物,甚至单体N-乙酰葡糖胺,失去致病性。该文主要介绍几丁质进入哺乳动物体内的方式及哺乳动物几丁质酶的作用,为防治含有几丁质成分的病原体侵袭哺乳动物产生的疾病研究提供思路及方向。     

烟曲霉的酶工程应用研究进展

本文着重介绍了烟曲霉产生的几丁质酶和植酸酶在酶学性质，相关基因，异源表达，酶解产物及其应用方面的研究进展，同时介绍了烟曲霉其它酶在国内外的一些研究进展。     

烟曲霉的酶工程应用研究进展

本文着重介绍了烟曲霉产生的几丁质酶和植酸酶在酶学性质,相关基因,异源表达,酶解产物及其应用方面的研究进展,同时介绍了烟曲霉其它酶在国内外的一些研究进展。     

家蚕几丁质脱乙酰基酶基因结构及mRNA选择性剪接与表达差异的研究

几丁质脱乙酰基酶(CDAs)是调控昆虫生长发育过程中的蜕皮生理、组织生长和抗病免疫等的重要酶类。利用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆了家蚕CDAs基因的cDNA全长序列,鉴定出BmCDA基因mRNA存在2种剪接体,命名为BmCDA1和BmCDA2,外显子遗漏是这2种剪接体mRNA的主要剪接模式。生物信息学分析表明,BmCDA基因由6个外显子和5个内含子组成;推测BmCDA1和BmCDA2编码氨基酸序列都包含几丁质脱乙酰基结构域、几丁质结合(ChBD)结构域和低密度脂蛋白受体A类(LDLa)结构域等3个功能域,但二者的ChBD结构域有部分氨基酸残基不同。基于功能域基序和系统进化分析,昆虫CDA蛋白可分成5大类,BmCDA1和BmCDA2属于第1大类,是具有全部3个功能域的典型昆虫CDA蛋白。荧光定量PCR分析表明BmCDA表达不仅具有发育时期特异性,而且具有组织特异性:在幼虫和蛹蜕皮前后的表达量最高,蜕皮后第2天表达量最低;在幼虫蜕皮时发生激剧变化的表皮、气管和中肠等组织中的表达量显著高于变化较小的中部丝腺和脂肪体等组织;BmCDA1主要在表达量高的发育时期和组织中表达,BmCDA2主要在表达量低的组织中表达。研究结果有助于进一步解析昆虫CDAs基因的功能和调控机制。     

几丁质酶高产菌株HF-3的筛选及发酵条件研究

为了筛选一株高产几丁质酶菌株,试验采用透明圈法,从长江沿岸、森林土壤泥浆样品中分离几丁质酶生产菌株,得到一株几丁质酶高产菌株(HF-3),进行了生理生化特性、菌落形态及16S r DNA序列测定,并采用单因素优化方法筛选最佳产酶条件。结果表明:该菌为地衣芽孢杆菌;在培养温度为34℃、接种量为5%、胶体几丁质为碳源、表面活性剂为吐温-80时,酶活力达1.58 U/m L,此为最佳产酶条件。     

黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析

本试验旨在从一株黑曲霉中克隆单宁酶基因,并研究其酶学性质。利用前期分离的一株黑曲霉菌株SL-5,克隆出单宁酶基因,基因全长1533 bp,编码510个氨基酸;使用大肠杆菌BL21作为宿主,并使用p ET32a(+)作为表达载体,实现了单宁酶基因在大肠杆菌中的表达。纯化的单宁酶能够降解单宁,酶的最适反应温度为40℃,最适反应p H为6.0。     

葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达

[目的]合成经过密码子优化的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因,并将2个基因在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中进行分泌表达。[方法]对瘤胃真菌(Piromyces rhizinflatus,P.rhizinflatus)的外切葡聚糖酶cbhYW23-1基因(Gen Bank登录号:EU314937.1)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)的内切葡聚糖酶end-1基因(Gen Bank登录号:X88561.1)进行L.lactis MG1363密码子偏爱性优化,并在2个基因的上游和下游分别引入ClaⅠ/XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,得到含有优化的cbhYW23-1基因和end-1基因的克隆载体p UC57-cbhYW23-1和p UC57-end-1;通过酶切后分别连接到构建的组成型分泌载体p MG36e+P32+SPusp45上,得到2个基因的表达载体,然后电转至L.lactis MG1363中,利用红霉素抗性筛选得到高拷贝转化重组子;以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为底物验证其活性及表达情况。[结果]成功地构建了cbhYW23-1基因和end-1基因的分泌型表达载体,2个基因均能够在L.lactis MG1363中高效稳定表达,2株重组菌株表达的外切葡聚糖酶酶活和内切葡聚糖酶酶活分别为118.80 U/mL和294.32 U/mL。[结论]密码子优化后的2个纤维素酶基因在L.lactis中获得理想稳定的表达,其高效基因工程菌的构建为将来实现这2种纤维素酶的工业化生产奠定了技术基础。     

家蚕丝腺发育相关基因Bmsage缺失突变体的RNA-seq分析

Bmsage是在家蚕丝腺中特异表达的基因,之前的研究明确其对丝素重链基因fib-H转录具有调控作用。在开展Bmsage功能的研究中,运用CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得了Bmsage缺失的纯合突变体家蚕,其表型特征是幼虫的丝腺异常发育,缺失中部丝腺和后部丝腺。以Bmsage缺失型家蚕及正常型家蚕产下后5 d的卵为材料,应用RNA-seq测序技术在转录水平上获得194个差异表达基因。对Bmsage缺失型家蚕突变体胚胎期的这些差异表达基因进行GO功能注释,结果显示:Bmsage基因缺失后,对家蚕生理功能的影响主要集中在一些细胞组分,如与肌肉功能相关的肌球蛋白基因和肌钙蛋白基因都明显上调表达,与碳水化合物代谢相关的基因如多种凝集素基因和糖苷酶基因,除个别下调表达外,其余均上调表达;排在前10的GO term中,出现较多的是与几丁质分解代谢相关的几丁质酶基因和多种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。KEGG信号通路分析显示:差异基因主要与一些糖类、脂类和氨基酸的代谢的信号通路相关,其中又以糖类代谢为主,如半乳糖代谢、糖胺聚糖降解及氨基糖和核苷酸糖代谢,所以Bmsage可能参与了多个糖类代谢途径;在差异基因中,与丝腺发育关系最大的是几丁质酶基因、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,以及一些转运RNA基因(如TRNAE-CUC、TRNAN-GUU、TRNADGUC和TRNAV-GAC)。因此推测Bmsage可能通过复杂的调控网络,参与了丝腺组织的分化与形成过程。     

脂蛋白脂酶研究进展

脂蛋白脂酶(LPL)是动物组织中脂肪沉积的关键酶,是甘油三酯降解为甘油和游离脂肪酸(FFA)反应的限速酶,在脂质代谢和转运过程中起着重要作用。脂蛋白脂酶基因的表达具有特异性,营养等因素能够影响动物LPL基因的表达和LPL活性。论文综述了LPL的生物学功能、LPL在脂肪沉积中的作用及其在单胃动物和反刍动物中的研究现状。     

Al_2O_3-脱乙酰几丁质作为酶固定化载体的研究

Al2O3作核心的脱乙酰几丁质颗粒可用作酶固定化的载体。观察了脱乙酰几丁质的浓度、脱乙酰度和分子量对酶的固定化的影响。发现以浓度为2．0％、脱乙酰度为85．0％、分子量为1．34×106d的脱乙酰几丁质制得的载体用于固定化酶效果最好。所得固定化GOD具有较高的固定化酶活力、热稳定性和工作稳定性。     

多不饱和脂肪酸对脂肪代谢酶基因表达的影响

多不饱和脂肪酸不仅可以抑制脂肪合成酶基因的表达,还能对脂质氧化相关酶基因的表达起促进作用,从而调节机体脂质代谢过程。本文主要就多不饱和脂肪酸的分类和来源、对脂肪合成及氧化相关酶基因表达的影响作一综述。     

杆状病毒与昆虫和沙雷氏菌间的几丁质酶基因密码子使用模式分析

为阐明杆状病毒几丁质酶基因(v-Chi A)密码子使用在病毒基因组进化的基因水平转移中发生的适应性变化,比较分析了杆状病毒v-Chi A与昆虫几丁质酶基因(Chi-h)、沙雷氏菌几丁质酶基因(Chi A)以及杆状病毒以lef-8、lef-9和polh/gran基因为代表的基因组(表示为lef8-lef9-pg)的密码子使用模式。结果表明,杆状病毒v-Chi A与昆虫Chi-h的GC含量、GC3s含量、有效密码子数(ENc)及与沙雷氏菌Chi A的GC含量均无统计学差异(P0.05);与杆状病毒lef8-lef9-pg的GC含量、GC3s含量、ENc值以及沙雷氏菌Chi A的GC3s含量、ENc值均有统计学差异(P0.05)。杆状病毒v-Chi A与lef8-lef9-pg、昆虫Chi-h和沙雷氏菌Chi A的同义密码子使用均高度相似(相似性系数分别为0.992、0.870、0.862)。选择与突变共同影响杆状病毒v-Chi A和lef8-lef9-pg的密码子使用,而昆虫Chi-h和沙雷氏菌Chi A的密码子使用完全由选择所影响。综上所述,杆状病毒v-Chi A的碱基组成及密码子偏好性与昆虫Chi-h相似,与lef8-lef9-pg不同;密码子使用的影响因素与lef8-lef9-pg相似,与昆虫Chi-h和沙雷氏菌Chi A不同。上述结果从密码子使用角度证实了杆状病毒v-Chi A来源于昆虫Chi-h的水平转移。