cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

茄子资源苗期田间青枯病抗性鉴定

采用浸根接种法对23份茄子资源进行苗期田间青枯病抗性鉴定,结果有3份资源对青枯病表现为高抗,3份资源表现为抗病。这些抗病资源具有较好的农艺性状,可以作为今后茄子抗青枯病新品种选育的抗源加以利用。     

广东主要茄子品种对青枯病的抗性鉴定与评价

收集了目前在广东生产推广种植的19个茄子品种,通过室内苗期人工接种,鉴定与评价了这些茄子品种对青枯病的抗性水平,结果显示:冠军紫红茄、长优紫长茄、华育二号紫红长茄、宏运茄王、长丰二号和新丰1号紫红长茄这6个品种对茄子青枯病表现为抗病;美丰三号紫长茄、紫龙长丰Ⅲ、福将紫红长茄、紫荣6号长茄、中冠二号紫长茄、金卡龙三号紫红...     

福州地区小菜蛾全长cDNA文库构建与分析

采用ZAP Express cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit试剂盒,构建了小菜蛾(Plutella xylostella)的全长cDNA文库.利用TRIzol试剂盒提取小菜蛾成虫总mRNA,通过Oligo试剂将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA产物为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得小菜蛾cDNA原始文库,其滴度为1.5×106pfu.mL-1.扩增后的cDNA文库的滴度为1.4×1010pfu.mL-1.取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取20-25个独立噬菌斑,用M13±通用引物PCR扩增后,测得文库的重组率大于95%,插入cDNA片段的长度平均为1.25 kb.该文库的构建,可为小菜蛾抗药性基因的相关研究提供一个平台.     

茄子青枯病发生特点及防治技术

青枯病是茄子在生长过程中的主要病害类型,主要发生在温度高、湿度高、多次连作等条件下。本文以粤北地区为例,针对当地的青枯病发生特点与防控技术予以分析与阐述,以期为农户提供技术参考。     

水稻cDNA酵母表达文库的构建及重金属镉胁迫相关基因的初步筛选

提取经重金属胁迫处理的水稻幼苗总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成cDNA,利用Gateway技术将cDNA构建到入门载体pDONR222后,再经LR反应重组到酵母表达载体pYES2-DEST52上,获得水稻cDNA表达文库。检测表明,所构建的cDNA文库能达到后续试验要求。使用重金属镉敏感酵母突变株ycf1Δ进行水稻中重金属镉耐受相关基因筛选,获得多个可以恢复表型的酵母单克隆。提取质粒并测序分析后可知涉及到水通道蛋白、蛋白酶抑制剂以及金属硫蛋白等不同基因,筛选所得基因即为水稻应答重金属镉胁迫的候选基因。     

茄子对青枯病的抗性遗传分析

为探讨茄子青枯病抗性的遗传,试验选取7个对青枯病抗性差异显著的材料,采用G riffing的双列杂交设计方案配制杂交组合,利用苗期人工接种青枯病病原菌方法测定亲本及F1组合青枯病发病率。经统计分析表明:茄子青枯病抗性遗传不符合"加性-显性"遗传模型,存在着非等位基因间的上位作用;茄子青枯病抗性主要受少数隐性基因控制,属隐性遗传。     

晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库构建及序列分析

以番茄抗病品系(CLN2037E)为研究材料,应用SMART技术构建晚疫病诱导的番茄叶片cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。成功构建的cDNA文库的克隆数为2.3×109,重组率为96%,通过PCR检测,插入片段范围在0.1~2.0 kb之间。从文库中随机挑取110个克隆进行测序,最终得到107条差异表达ESTs序列。GenBank提交的序列号为GT742146-GT742150;GT865998-GT866099。利用BLAST进行同源性分析:75条ESTs与其他物种同源性较高,视为已知基因,功能涉及能量代谢的占42.7%、细胞内生命活动与信号传导的占10.7%、基因转录和翻译的占9.3%以及与抗性相关的占25.3%;另有32条ESTs无同源序列或同源性较低,预测是一些未知功能基因的占30%。本项研究应用SMART技术成功构建了高质量、信息丰富的晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库,为进一步筛选抗病相关候选基因奠定了基础。     

甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。     

茄子抗青枯病材料的抗性鉴定及应用价值探讨

青枯病是危害茄果类蔬菜的主要病害之一,是一种细菌性土传病害,由青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起[1].该病在我国南方地区发病率极高,重病区可造成毁灭性灾害.迄今为止,还没有发现有效的杀菌剂,化学防治收效甚微.因此,培育抗性品种是防治该病的有效手段[2].国内外对番茄青枯病病原菌的鉴定、致病机理、抗性材料鉴定及抗性育种等方面做了大量的研究,取得了显著的成绩[2].但对茄子青枯病研究并不多,其研究主要集中在印度和亚洲蔬菜研究与发展中心(AVRDC,中国台湾),现已鉴定出一批茄子抗青枯病材料[7～8,10].到目前为止,国内对茄子青枯病研究方面的报道很少.我所从AVRDC引进了一批茄子青枯病抗性材料并在重庆地区作了抗性鉴定,本试验旨在鉴定这些抗性材料的地区适应性及其农艺性状表现,为抗性材料的利用提供参考.     

紫外线胁迫的花生幼果cDNA文库构建与RS cDNA的分离

紫外线胁迫可导致花生产生白藜芦醇的诱导合成防御反应,本研究在利用UV处理花生幼果、激发花生幼果防御反应的基础上提取总RNA,应用SMART-cDNA文库构建试剂盒构建了花生幼果的cDNA文库.该文库含有1.0×106独立克隆,插入片段平均1 kb左右.利用所构建的cDNA文库,采用96孔板PCR筛选方法,分离获得2个白藜芦醇合成酶cDNA.     

小麦cDNA文库构建方法的改进及优化

基于SMART法,优化cDNA文库构建方法。将常规SMART法中的限制性内切酶SfiI替换成BsaI,在引物两侧分别加入BsaI-XhoI和BsaI-BamHI酶切位点,仅使用BsaI单酶切即可获得两不同的粘性末端,可用于连接任意载体。应用此方法构建了小麦cDNA文库,获得2.7×104个独立克隆,文库平均长度500bp。     

茄子抗青枯病基因RAPD标记的初步研究

通过RPAD方法，首次对茄子抗青枯病材料WCGR112－8进行了抗性基因标记的初步研究。结果表明，引物OPL12扩增的多态性片断OPL12－400只在抗性亲本WCGR112－8和F2代抗病池中出现，感病亲本和F2代感病池中不存在。这一标记很可能是有用的抗病基因标记。但要进一步确定其与抗性基因的紧密连锁关系，尚需对F2群体进行单株RAPD分析后方能明确。     

茄子青枯病的发生与防治

茄子青枯病发病时间,发病症状,病原,发病条件,以及青枯病的主要防治方法。     

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA,用SMART cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.1×108Pfu/ml,文库有500μl体积,库容量为5.5×107Pfu,通过PCR检测,文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.8~1.8 kb,平均插入片段长度约为1.34 kb。这些数据表明,已获得高质量的海带cDNA文库,为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。     

茄子抗青枯病的育种方法研究

用高抗青枯病的抗源材料与符合育种目标的优良经济性状材料有性杂交，然后进行幼苗期鉴定，淘汰感病株系或感病苗，再对抗性苗进行成株期鉴定及经济性状选择的育种思路，适用于茄子抗青枯病育种。但要获得抗性水平及经济性状均符合育种目标的材料，需要较长的育种时间。对茄子抗青枯病育种研究中发现，经系统选育，虽能筛选出一些高抗青枯病的材料，但经济性状与育种目标尚有一定距离，说明茄子抗青枯病育种是比较困难的。因此，我国茄子抗青枯病育种应采取两步走：第一步进行抗青枯病茄子砧木品种的选育，茄子砧木可以直接利用茄子近缘种或野生种及半栽培种；第二步利用茄子近缘种或野生种及半栽培品种作为青枯病的抗源材料，与具有优良经济性状材料进行远缘杂交，选育高抗青枯病的茄子品种。分两步走，既能解决目前生产上急需茄子抗病品种的问题，又能兼顾长远。