志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT-ⅡeA在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白.用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为A2-D3,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗检测13株水肿病菌株,发现均产志贺样毒素Ⅱ型变异体.     

非洲绿猴肾细胞传代培养中细胞消化液的优化试验

通过比较0.25%胰蛋白酶和改良的细胞消化液(0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶)对非洲绿猴肾(Vero)传代细胞系的消化分散效果,确定最适合实际生产需要的细胞消化液。结果表明,用改良的细胞消化液消化Vero传代细胞系,消化时间短,消化效果好,优于0.25%胰蛋白酶的消化效果。     

贵州猪、牛志贺样毒素大肠杆菌的检出与鉴定

以两对全盛的寡核苷酸引物,通过聚合酶链式反应,检测158份猪和牛腹泻粪便分离物,从8份猪源和3份牛源分离物中扩增出大肠杆菌志贺样毒素基因片段,其生化试验符合大肠杆菌特征,经Vero细胞检测均产生志贺样毒素,血清学试验证实分属不同的血清型,与志贺样毒素大肠杆菌血清型范围相符。     

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得１株针对志贺氏菌样素Ⅱ为异体９Ｓｈｉｇａ－ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ Ⅱ ｖａｒｉａｎｔ,ＳＬＴ－Ⅱｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞,并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株,发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应,与产ＳＬＴ－Ⅱ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应,但与产ＳＬＴ－Ⅰ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ     

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其致病性研究

应用Vero细胞对江苏省某猪场腹泻病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、RT-PCR扩增、动物回归试验对病毒进行鉴定,通过半数致死量测定病毒的致病性.结果显示,成功分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),命名为PEDV JS14株.该毒株在Vero细胞上盲传至4代出现细胞病变,主要表现为细胞面粗糙、颗粒增多,细胞多核呈空...     

广西猪水肿病志贺样毒素大肠杆菌的分离与鉴定

1材料与方法1.1材料样品采自桂林、玉林、南宁等地患水肿病仔猪器官组织样品。1.2培养基及参考菌株按常规方法制备麦康凯琼脂培养基、伊红-美蓝琼脂培养基和普通琼脂培养基;生化鉴定培养基购自杭州天和生物技术有限公司。参考菌株:DH5α为本实验室保藏菌株。1.3试剂Taq DNA聚合     

藏羊巨型住肉孢子虫体外培养方法的建立

为了建立青海藏羊巨型住肉孢子虫体外培养方法,以贴壁生长和形态完整的非洲绿猴肾细胞(Vero)作为宿主细胞,将青海藏羊巨型住肉孢子虫缓殖子(1.25×104个/mL)接种于宿主细胞,连续培养21d,期间观察记录其生长发育状况。结果表明,藏羊巨型住肉孢子虫在Vero细胞中生长良好,并在培养液中观察到游离的虫体卵囊,21d后均可分离、纯化出新一代的缓殖子。说明在实验室条件下,成功建立了藏羊巨型住肉孢子虫稳定的体外培养方法。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第298～805序列、818～1201序列进行了扩增，使其第806～817序列的碱基(编码167～l70位氨基酸)缺失，并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX-6P-1中，获得了含有重组质粒pGEX-Ade。的重组大肠埃希氏菌；经SDS-PAGE以及使用特异性抗SLT-Ⅱ eA单克隆抗体的Western-blotting，证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT-Ⅱ eA。     

时刻警惕传染性法氏囊病的发生

<正>1病原传染性法氏囊病病毒属于双核糖酸病毒,能在鸡胚及鸡胚成纤维细、肾细胞、非洲绿猴肾细胞及幼素领肾细胞等各种细胞上生长良好,并产病理变化。     

生物反应器悬浮培养Vero细胞制备水貂犬瘟热活疫苗

为实现利用生物反应器制备规模化、自动化生产水貂犬瘟热Vero活疫苗,在7 L生物反应器中悬浮培养Vero细胞,并考察培养基、细胞初始接种密度、培养方式、病毒感染复数和感染时间等参数对细胞增殖、病毒滴度以及细胞代谢的影响。结果显示,在含有5 g/L微载体的DMEM培养基中接种Vero细胞(30～40 cells/球),设定p H、温度、溶氧值和转速分别为7.2、37℃、50%和55 r/min,培养方式为批次培养(0～48 h)+灌流培养(48～96 h)组合方式,培养Vero细胞3～4 d或细胞密度达到200 cells/球以上时,按照MOI=0.0001～0.001吸附接毒,调低温度(33℃)继续培养100～120 h,即可获得高滴度病毒液(10~(6.5)～10~(7.2)TCID_(50)/0.1 m L),经无菌检验合格后,配制水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV3-CL株,悬浮培养),疫苗符合《中国兽药典》三部(2015版)的规定。试验建立了7 L生物反应器悬浮培养Vero细胞制备水貂犬瘟热活疫苗的新工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

产志贺毒素大肠杆菌的流行病学及致病因子的研究进展简

产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）是一类危害严重的食源性病原菌，能引起人类的严重疾病，如出血性结肠炎、溶血性尿毒症等，牛、羊等反刍动物是引起人类发病的主要宿主来源。作者总结了产志贺毒素大肠杆菌病的流行病学现状，就产志贺毒素大肠杆菌染色体和毒性质粒上的主要毒力因子的研究进展作一综述。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

为建立针对仔猪水肿痛SLT-Ⅱe毒素的检测方法,应用PCR技术克隆SLT-Ⅱe B基因,并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达.以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术获得6株稳定分泌抗SLT-Ⅱe B的单克隆抗体(McAb)细胞株,其抗体亚类包括IgM、IgA、IgG2b和IgG2a,而且轻链均为K链.阻断ELISA结果显示,6株McAb均能特异性识别天然SLT-Ⅱe毒素.相加ELISA结果显示,3G7和4F3两株是针对不同抗原表位的McAb.     

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位及酶活性部位的基因缺失、突变株表达产物免疫生物学特性

重组志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位pGEX-Ansp及其酶活性部位的基因缺失株pGEX-Ade及突变株pGEX-Amu转化的大肠杆菌经诱导后,表达产物经超声波裂解并滤过除菌.ICR小鼠腹腔注射三种重组质粒转化菌诱导后菌体裂解物的除菌滤液,以检验重组表达产物的毒性和免疫原性;在Vero细胞上检测重组菌表达产物对Vero细胞的半数致死量(CD50)及免疫鼠血清对SLT-Ⅱe毒素的中和实验三方面来比较pGEX-Ansp、pGEX-Ade和pGEX-Amu的生物学特性,结果表明这三种基因工程菌表达产物经腹腔注射后可以诱导机体产生一定程度的保护性抗体.在Vero细胞上,pGEX-Ansp的表达产物可在一定程度上使Vero细胞产生细胞病变,pGEX-Amu的表达产物可在一定程度上抑制Vero细胞单层形成时间,而pGEX-Ade对Vero细胞的生长无影响.     

产志贺毒素样大肠杆菌F18ab菌毛操纵子基因的体外非诱导系统的表达和鉴定

以产志贺毒素样大肠杆菌（SLTEC）F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明：兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000（pBR322-fed）进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明：重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。     

猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。     

犬瘟热诊断技术

一、范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的操作方法。二、试剂和材料2.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基2.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)2.3磷酸盐缓冲液(PBS)2.4青霉素、链霉素2.5CDV阳性血清:中和抗体效价1·1024。2.6CDV阴性血清:无CDV感染的犬血清。