溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护试验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110～150g的大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109cfu/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示,第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护实验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110~150g大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109CFU/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示:第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

养殖大菱鲆鳗弧菌疾病的初步研究

从某养殖场患病的大菱鲆病灶和肝肾等组织分离到一株病原菌YC-01,经人工感染健康大菱鲆后,其皮下、鳍基部、及口部皮下出血,皮肤溃烂、腹部膨胀等,与自然发病大菱鲆的症状相同.药敏实验结果表明,菌必治、氟哌酸、呋喃妥因、复达欣、红霉素、卡那霉素,对YC-01有较强的抑制作用,该菌株对四环素、磺胺类、青霉素等抗生素有耐药性.经过光镜和电镜的综合形态观察,生理生化特征测试,标准菌种比对等,可将病原菌CY-01鉴定为鳗弧菌.     

嗜水气单胞菌和河弧菌二联疫苗对鲫鱼的免疫效果

在采用正交试验设计优化了Aeromonas hydrophila和Fibrio fluvialis二联全菌疫苗制备工艺的基础上．研究了采用该工艺所制备的疫苗对鲫鱼的免疫保护效果。结果表明注射免疫鲫鱼4周后,抗A.hydrophila和V．fluvialis血清凝集效价分别为1：4-1：32和1：2-1：16,平均都为1：10,但对攻毒均具有有效的保护作用。浸泡免疫、高渗浸泡免疫或加多糖浸泡免疫在免疫4周后,对A．hydrophila攻毒均无保护作用;然而,加多糖浸泡免疫对V.fluvialis攻毒可产生有效的保护。免疫扩散试验表明,在煮沸并经超声波处理后的A．hydrophila或V.fluvialis菌液中均存在两种优势抗原。     

注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾,测定了弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的影响以及疫苗的免疫保护作用。结果表明,注射溶藻弧菌疫苗后,血清凝集效价增强,24 h时活力达到最高值,尤其是1.08×108cell/ml组的凝集效价升高最明显,为对照组的6.0倍;在24 h时,3个试验组的凝集效价均明显高于对照组(P<0.05)。溶菌活力注射后6 h即达到最高值,1.08×107、1.08×108cell/ml组的溶菌活力明显高于对照组(P<0.05)。抗菌活力在注射后3 h时最高,明显高于对照组。溶血活力在注射疫苗后有所增强,注射后6 h时1.08×106、1.08×107cell/ml组的活力达到最高,而1.08×108cell/ml组12 h时活力达到峰值。注射疫苗对血清超氧化物歧化酶活力基本没有影响。1.08×106、1.08×107、1.08×108cell/ml对南美白对虾的免疫保护率分别为46.3%、61.0%和75.6%。     

鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究

制备鳗弧菌福尔马林灭活的全细胞疫苗，腹腔注射接种牙鲆，50d后进行第2次免疫。利用自制的兔抗鱼血清的抗血清通过ELISA实验检测了受免鱼特异性免疫应答水平，并通过攻毒实验，测定了疫苗对牙鲆的免疫保护率。结果表明，各免疫组血清抗体效价的最高值分别达1：512、1：2048、1：1024；各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用。用鳗弧菌攻毒后，免疫保护率分别达81．25％、87、50％、93．75％，而且发现受免鱼对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)也表现了一定的交叉保护性，免疫保护率分别为46．15％、53．85％、53．85％。     

多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价

采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和77.0％;用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97;用多效价载体疫苗浸泡免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.     

哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究

采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS).通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联.OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳鲹(Trachinotus cvatus).检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳鲹经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单混合物免疫后,各免疫组间血清溶菌酶活性没有显著差异(P＞0.05),但均显著高于生理盐水对照组(P＜0.05);OMPC-LPS偶联物免疫组的血清抗溶藻弧菌EpGS021001抗体效价较单纯溶藻弧菌LPS免疫组、简单混合物免疫组出现得早,抗体滴度高;与此类似,OMPC-LPS偶联组中抗哈氏弧菌SpGY020601的血清抗体效价较单纯哈氏弧菌OMPC组、简单混合组出现得早,抗体滴度高,且持续时间长;对EpGS021001、SpGY020601的攻击,OMPC-LPS偶联物免疫组的保护率分别为85%和95%,高于单纯溶藻弧菌LPS免疫组的70%、单纯哈氏弧菌OMPC免疫组的75%,也高于简单混合物免疫组的80%和82.5%.     

二种佐剂对哈氏弧菌OMPC-溶藻弧菌LPS偶联疫苗的增效作用

制备哈氏弧菌SpGY020601外膜蛋白复合物(OMPC)和溶藻弧菌EpGS021001脂多糖(LPS)偶联疫苗,设置偶联疫苗组、偶联疫苗 ISA763佐剂组、偶联疫苗 β-葡聚糖佐剂(DEAE)组以及生理盐水对照组,并以相同程序免疫卵型鲳鲹。溶菌酶活性检测、微量凝集反应试验结果显示:各疫苗组血清中的溶菌酶含量无显著差异(P>0.05),但均远高于生理盐水对照组(P<0.05);ISA763佐剂组抗哈氏弧菌SpGY020601抗体滴度较其他组出现的早,抗溶藻弧菌EpGS021001抗体滴度较其他组持续时间长;β-葡聚糖佐剂组次之,其次是无佐剂组,对照组始终未检测到抗体。各组分为腹腔注射攻毒与浸泡攻毒,对EpGS021001的攻击,ISA763佐剂组相对保护率分别为90%和70%,高于β-葡聚糖佐剂组的85%和55%,以及无佐剂组的80%和55%;对SpGY020601的攻击,ISA763佐剂组相对保护率分别为95%和80%,高于或相当于β-葡聚糖佐剂组的95%和75%,以及无佐剂组的90%和75%。     

鳗弧菌O1/O2二价灭活疫苗免疫大菱鲆的抗体持续期和免疫保护期

本研究分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)O1/O2血清型二价灭活疫苗免疫大菱鲆后的抗体持续期和免疫保护期。以鳗弧菌O1血清型VAM003株和O2血清型VAM007株为抗原制备了福尔马林灭活二价疫苗,将疫苗按照三种剂量(10~7 cells/尾、10~8 cells/尾、10~9 cells/尾)以腹腔注射途径免疫大菱鲆,在免疫后3 d、7 d、14 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d,用血清凝集实验检测了免疫鱼血清的VAM003和VAM007抗体效价,用攻毒实验检测了疫苗的免疫保护率(RPS)。结果显示,在免疫后7 d三个剂量组的大菱鲆均产生了特异抗体,并获得27%～60%的RPS。三个剂量组大菱鲆的O1血清型抗体持续期分别90 d (10~7 cells/尾组)、150 d (10~8 cells/尾组)、150 d (10~9cells/尾组),而三个剂量组大菱鲆的O2血清型抗体持续期均150 d。三个剂量组的大菱鲆获得的免疫保护持续期均150 d;以RPS75%为有效免疫保护,各剂量组大菱鲆抵抗O1血清型病原感染的有效免疫保护期为:14～120d(10~7 cells组)、14～120 d (10~8 cells/尾)、14～150 d (10~9 cells/尾),抵抗O2血清型病原感染的有效免疫保护期为:14～60 d (10~7 cells组)、14～120 d (10~8 cells/尾)、14～120 d (10~9 cells/尾)。研究结果表明鳗弧菌二价灭活疫苗可为大菱鲆提供有效而稳定的免疫保护,获得的抗体持续期和免疫保护期为该疫苗的临床中试研究提供了基础。     

鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性

分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。     

鳗弧菌口服微胶囊疫苗的制备及其对鲈鱼的免疫效果

以分离自患病鲈鱼(Lateolabrax     

A selective and differential medium for Vibrio alginolyticus

In this paper, we present a selective and differential medium, termed Vibrio alginolyticus (VAL) agar, developed for the isolation and identification of V. alginolyticus. The presence of bile salts, high salinity and high incubation temperature allows the selective growth of moderately halophilic Vibrio species. Differentiation of bacteria is achieved by identifying species capable of sucrose fermentation, made visible by the pH indicator bromocresol purple. In this study, all of the 26 strains of V. alginolyticus and only three of the 99 strains representing 30 species (including 19 Vibrio species) other than V. alginolyticus were able to grow in the VAL medium. The remaining three strains could be further differentiated from V. alginolyticus according to colour or the diameter of colonies produced on VAL agar plates. Colonies isolated from shellfish rearing water and infected shrimp through the use of VAL agar plates were all positively identified as V. alginolyticus by conventional tests and 16S rDNA sequencing. The testing of specificity and differentiation capability of VAL shows the potential of the agar as a medium for the primary isolation of V. alginolyticus from pathological and environmental samples.     

致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法研究静置培养条件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶标板上成膜情况。结果显示,溶藻弧菌的生物膜的OD590在16h达到峰值后,随培养时间延长出现下降;在102～108cfu/mL范围内,不同的初始菌密度对生物膜的OD590影响并不显著;NaCl质量分数为4.5%时,所形成生物膜的OD590最高;30℃,溶藻弧菌的生物膜OD590显著高于其他温度组(P0.05);在胰蛋白胨大豆肉汤培养液中加入质量分数1.5%的CaCl2,能够显著促进生物膜形成,而加入MgCl2对于生物膜的影响则不显著;经过大黄鱼表皮黏液包被后,96孔板中生物膜的OD590显著高于其他部位组织提取液包被组(P0.01)。致病性溶藻弧菌ND-01能够在聚苯乙烯材料的96孔酶标板表面形成稳定而明显的生物膜,且其生物膜的形成与多种环境因素有着密切关系。     

鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫效果研究

利用Western-blot技术,对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析,并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异,以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗,并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明,培养基中加入不同浓度的联铁剂,鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化,其中加入100~130μmol·L-1 2,2’-联吡啶为最适合限铁条件,此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下,菌株表达出74.3ku和77.4ku的IROMPs,其中77.4ku蛋白具有免疫反应性,为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔注射免疫牙鲆7周后攻毒, IROMPs疫苗的相对免疫保护力达到75.9%,远高于OMPs疫苗的51.8%。相对于OMPs,IROMPs的抗体效价显著提高,接近全菌疫苗组的水平,而血清杀菌活力没有显著变化。 关键词：鳗弧菌;铁调节外膜蛋白;牙鲆     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...