梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-1和HaFT-2克隆及表达分析

根据前期梭梭干旱转录组测序得到的Unigene序列,成功克隆2个梭梭14-3-3蛋白基因,分别命名为HaFT-1和HaFT-2,并对其进行基因表达分析。结果表明:HaFT-1基因在梭梭的根、种子中均可表达,且根中表达最强;HaFT-2基因在梭梭同化枝中表达最强,根的表达量次之。干旱胁迫后HaFT-1和HaFT-2基因的表达量均下调。本研究初步分析HaFT-1、HaFT-2基因的表达模式,为进一步研究该基因功能奠定基础。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析

[目的]克隆分析香蕉中14-3-3蛋白编码基因。[方法]采用PCR与RACE技术相结合的方法克隆香蕉14-3-3基因,并进行CDNA测序及同源性分析。[结果]所克隆cDNA全长866 bp,编码197个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的特征结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的序列相似性,将其命名为Ma-14-3-3d(Musa acuminate14-3-3gene)。[结论]Ma-14-3-3d蛋白与来源于单子叶植物的14-3-3蛋白位于同一进化枝上。     

小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致（260 aa左右）;在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式（80%）存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。     

普通菜豆14-3-3蛋白基因PvGF14h的克隆及冷胁迫诱导表达分析

根据14-3-3蛋白的保守性及菜豆基因组信息,从普通菜豆品种东北小油豆中克隆了一个14-3-3蛋白基因PvGF14h.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白以α螺旋为主导结构,具有典型的14-3-3蛋白结构域,主要分布在细胞质与过氧化体中,具有磷酸化位点;序列比对及进化树分析表明,它与大豆14-3-3蛋白SGF14h有较高的同源性(可达98.1％);进一步利用实时定量RT-PCR分析PvGF14h响应冷胁迫的表达模式,结果表明该基因的表达随着冷胁迫处理时间的增长而增加,因此推测PvGF14h可能参与了冷胁迫的信号转导过程.这些关于菜豆14-3-3蛋白基因的基本信息为进一步研究其功能尤其在响应低温胁迫方面奠定了基础.     

甘蔗14-3-3基因真核表达载体构建及分析

该实验拟构建甘蔗14-3-3基因的真核表达载体,为体外研究该蛋白功能和高级构象特征奠定基础。用RT—PCR技术从甘蔗茎中扩增出编码14-3-3蛋白的全长基因,并连入pGEM—T载体中,双酶切和测序用于序列正确性的鉴定。结果表明,该基因的最大开放阅读框为771bp,编码6256个氨基酸。后将所得cDNA片段亚克隆至真核表达载体pPIC9K,经电转后在酵母细胞中表达,表达产物经Westernblot鉴定分子量约为28kD。表明已成功构建了甘蔗14—3—3蛋白真核表达载体,并获得了表达产物。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

甘蔗14-3-3基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗14-3-3基因并预测分析其编码蛋白的结构,为研究甘蔗基因功能和代谢调控机制提供参考.[方法]以水稻14-3-3基因为模板,BLAST甘蔗EST数据库,依据序列拼接结果及RT-PCR技术获得编码甘蔗14-3-3蛋白的全长基因,并用生物信息学方法对该蛋白的二级、高级结构和功能活性位点进行预测.[结果]克隆得到长784bp的甘蔗14-3-3基因,最大开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸;该蛋白的分子量与理论等电点分别为28.88 kDa和4.79.蛋白聚类分析结果表明,甘蔗14-3-3蛋白与水稻、高粱、玉米14-3-3蛋白的同源性均在90％以上.Cn3D V.4.1预测位于第3和第5两个二聚体上的Lys-50、Arg-57、Arg-131和Try-132组成一个凹穴,是结合靶蛋白的作用面;第60、65、188、218位的4个丝氨酸是磷酸化的活性位点.实时定量PCR检测结果表明,14-3-3基因在甘蔗不同组织中均有表达,在茎和分生组织中14-3-3基因高丰度表达,可能与糖代谢和细胞分裂的调控相关;而在根中可能参与矿物元素的吸收和代谢.[结论]甘蔗14-3-3基因可作为信号转导调控蛋白的候选基因之一.     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因（Bactrocera dorsalis 14-3-3,Bdor 14-3-3）,研究Bdor 14-3-3 mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor 14-3-3;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头（去除触角）和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28 和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor 14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor 14-3-3可能发挥着重要作用。     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因(Bactrocera dorsalis14-3-3,Bdor14-3-3),研究Bdor14-3-3mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor14-3-3;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头(去除触角)和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor14-3-3可能发挥着重要作用。     

杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式研究

14-3-3蛋白在植物细胞信号传导中发挥重要的作用,探索木本植物14-3-3蛋白家族的进化模式对深入理解该基因家族的功能有重要的指导意义。本文采用生物信息学的方法,在基因组水平上搜索和鉴定了12个杨树14-3-3蛋白基因,其中ε类有7个,非ε类有5个。通过对杨树14-3-3基因家族的系统进化、序列相似性、基因结构和染色体位置分析,发现杨树14-3-3基因的扩张主要是通过最近的一次全基因组加倍事件产生的。在全基因组加倍事件中共产生5对重复基因对,Ka/Ks分析显示这5对重复基因对处于较强的净化选择压力。RT-PCR分析显示在杨树12个14-3-3基因中有8个在不同组织中均表达,另外4个基因的表达部位发生了变异。因此,杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式的研究结果预示着基因重复后其功能发生了分化。     

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析(英文)

[Objective] The aim of the study is to clone and analyze the gene encoding 14-3-3 protein from banana. [Method] Combined with PCR amplification, RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique was employed to clone 14-3-3 gene from banana; then the amplified sequence was sequenced and homologically analyzed. [Result] A new cDNA homologous with 14-3-3 protein genes were obtained by RT-PCR and RACE ( rapid amplification of cDNA ends ) approaches. The full length of this cDNA was 866 bp encoding 197 amino acids. Alignment of deduced amino acid sequence with those from other plants revealed that the cDNA shared high homology with 14-3-3 protein genes from other plants, and was designated as Musa acuminata 14-3-3 gene (Ma-14-3-3d). Phylogenetic analysis reveals that Ma-14-3-3d has closer genetic relationship with those from monocotyledon species than those from other species. [Conclusion] Ma-14-3-3d belongs to the same lineage of 14-3-3 from monocotyledon.     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9的克隆及特性分析

【目的】分析梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9在不同胁迫下的表达模式,解析HaFT-9蛋白结合特性,为研究梭梭抗逆分子机制提供理论基础。【方法】以梭梭cDNA为模板克隆14-3-3蛋白基因HaFT-9,利用qRT-PCR技术对该基因在不同胁迫下的表达模式进行分析,并通过酵母双杂交实验验证HaFT-9蛋白结合特性。【结果】克隆得到ORF长度为789 bp的梭梭14-3-3蛋白基因,命名为HaFT-9。梭梭幼苗在20% PEG6000、200 mmol/L NaCl和100 μmol/L ABA处理下,HaFT-9的表达量均在胁迫6 h时达到峰值,在20 μmol/L IAA处理下,HaFT-9的表达量在胁迫1 h时达到峰值。梭梭幼苗经40、55℃和55、65℃模拟地表高温胁迫,高温胁迫适应性试验中的常温复原阶段HaFT-9均上调表达。酵母双杂交实验表明HaFT-9可与自身形成同源二聚体。【结论】克隆得到HaFT-9基因(登录号为API85525.1),该基因可响应干旱胁迫、盐胁迫、ABA和IAA处理,并与高温胁迫适应性相关,HaFT-9蛋白能与自身互作形成同源二聚体。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

菠萝AcMADS41基因的克隆及其在花发育中的表达分析

[目的]AP3基因在多种植物花器官发育中具有重要作用,但在菠萝中关于AP3基因及其功能的研究尚无相关报道,对其研究可为AcMADS41在菠萝花发育中的功能鉴定提供理论依据.[方法]以菠萝花芽为材料,克隆到一个与花器官发育有关的AP3基因AcMADS41.通过生物信息学分析方法对其理化性质、蛋白结构域、进化关系、顺式作用...     

马铃薯腐烂茎线虫14-3-3基因的克隆与序列分析

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是为害中国甘薯生产的主要病原物之一,由它所引起的甘薯茎线虫病,每年造成严重的经济损失。14-3-3蛋白是真核生物特有,具有高度的保守性,且在信号转导代谢调控、激素信号传导、细胞分裂和对生物和非生物刺激的应答反应等过程起到重要作用。本研究采用EST分析和RACE克隆相结合的方法,从马铃薯腐烂茎线虫中成功克隆出一个14-3-3蛋白基因（Dd-14-3-3a,GenBank accession NO.:ADW77527.1）。Dd-14-3-3a cDNA全长为986 bp,包含一个长度为756 bp的开放阅读框,编码着一个长度为251 aa的蛋白质。Blast比对结果表明：Dd-14-3-3a蛋白与已报道的南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）以及水稻干尖线虫（Alphelenchoides besseyi）中的14-3-3蛋白的一致性分别为98%、98%、98%和97%。对该蛋白结构的分析结果表明：Dd-14-3-3a蛋白包含一个典型的14-3-3蛋白结构域,且无信号肽和跨膜结构域。该基因的克隆和分析将有助于明确植物寄生线虫14-3-3蛋白在线虫侵染和与寄主互作中的作用。     

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。