猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。     

猪ERK6基因编码区的克隆及组织表达谱分析

利用RT-PCR方法扩增了猪ERK6基因编码区的序列，将扩增产物与pMD18-T载体连接，构建了重组质粒；重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；采用Northern杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同部位骨骼肌中分析了ERK6基因转录本的个数、大小及组织表达谱。结果显示，所克隆的猪ERK6基因片段长1113bp，含有1个1104bp的开放阅读框（ORF），该ORF编码367个氨基酸；该基因与已报道的人ERK6基因核苷酸序列相似性为90％；猪ERK6基因在肌肉组织中只有一个转录本，大小约1．5kb。此基因在骨骼肌中的表达量最高，心、子宫次之，卵巢最低；而在脂肪、胃、肝、脾、肺、肾、十二指肠和胰腺中未见表达。结果表明，猪ERK6基因与已报道的小鼠和人ERK6基因一样，主要在骨骼中特异表达。     

猪MyD88基因的克隆及组织表达谱分析

本研究旨在克隆猪MyD88的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异.利用RT-PCR技术从猪肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪MyD88的cDNA序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用Real-time PCR技术对MyD88基因的组织表达谱进行了分析.序列分析结果表明克隆到的序列全长为897 bp(EF198416),其882 bp的开放阅读框编码的293个氨基酸残基组成猪髓样分化因子88(MyD88);推导的氨基酸序列分析显示:猪MyD88蛋白具有典型的死亡结构域和TIR结构域,相似性分析结果显示,MyD88在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、褐鼠和小鼠的氨基酸序列相似性分别为88.4%、85.7%、78.8%和78.2%;Real-time PCR结果表明:MyD88在11个组织中的相对表达水平存在差异,其在派伊氏小体和肠系膜淋巴结中表达量相对较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.猪MyD88基因的克隆和表达研究为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

猪新基因NPM1的克隆、序列分析与染色体定位

克隆了猪NPM1基因的cDNA和第4内含子序列，并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1195bp且包含一个完整的开放阅读框，编码294个氨基酸。内含子序列长300bp，遵循GT／AG剪接法则。序列分析表明，该基因与已报道的人、大鼠和小鼠等物种的NPM1基因高度同源，氨基酸序列同源性分别为95％、91％和91％。该基因编码的蛋白具有Nucleoplasmin保守功能域。用体细胞杂种板将该基因定位在猪16号染色体q21区段，辐射杂种板定位结果表明该基因与猪16号染色体上SW977标记紧密连锁。     

猪PGC-1β和PRC基因的部分cDNA克隆及表达分析

以猪心脏组织为材料,克隆猪PGC-1β(PPARγcoactivator-1β)和PRC(PGC-1-related coactivator)基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析,同时明确其组织表达特征。根据人PGC-1β和PRC基因的已知mRNA序列和在猪ESTs数据库中搜索得到的同源序列,利用RT-PCR技术克隆猪PGC-1β和PRC基因的部分cDNA序列,并用SQ-RT-PCR和Western blot方法检测其在猪心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、小肠、脂肪组织中的表达。结果,获得长度分别为1251和1254bp的猪PGC-1β和PRC基因的部分序列,分别编码415和417个氨基酸(GenBank登录号分别为:FJ377680和FJ479791),其核苷酸序列和氨基酸序列与其它物种的同源性均达到80%左右,并包含有TPPT-TPP和DHDY2个保守性序列,以及RNA识别基序(RRM)的保守性结构域。PGC-1β在8个组织中均有表达,而PRC主要在心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌中表达,在脾脏和小肠中未检测到。本研究成功获取了猪PGC-1β和PRC基因部分序列,且组织表达存在差异,所获得的结果为研究PGC-1家族的生理功能及调节机制积累了资料。     

BPI基因在梅山猪初生断奶以及成年阶段的组织表达谱分析

为探讨杀菌/通透性增强蛋白(BPI)基因在梅山猪从初生到成年各个时期不同组织中的表达规律,利用qPCR检测初生、断奶、性成熟、体成熟4个重要发育时期(即1、35、134、158日龄)梅山猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠和回肠12个组织中BPI基因的表达水平。结果表明:4个不同发育阶段BPI基因的组织表达谱在心脏、肝脏、脾脏、肌肉和胸腺中均表现出相对一致的规律,即BPI基因的表达量一直处于极低水平,而在肠道组织中从初生到成年各时期均高度表达;BPI基因在胃中的表达程度随着日龄增长而显著提高;在小肠组织中,35日龄断奶仔猪BPI基因的表达水平极显著高于其他3个日龄。综上,推断肠道中BPI基因的高度表达是仔猪从初生就具有的抵抗大肠杆菌等病原感染属固有免疫的一部分,而在胃中的表达很可能是其后天为了抵御不断侵染的大肠杆菌等病原的结果。     

从江香猪ApoC3基因的克隆及亚细胞定位研究

为了观察从江香猪载脂蛋白C3(ApoC3)基因及其表达产物在真核细胞中的亚细胞定位情况,以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,克隆ApoC3基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoC3重组质粒,转染HEK-293T细胞。结果显示:从江香猪ApoC3基因与GenBank上公布的序列相比,在141位有1个碱基发生转换,由腺嘌呤(A)突变成鸟嘌呤(G),为无义突变;对ApoC3蛋白的亚细胞定位分析表明,该蛋白在胞外基质占55.6%,内质网占22.2%,液泡占11.1%,细胞质占11.1%。pEGFP-C1-ApoC3重组质粒转染HEK-293T细胞后的荧光共定位结果显示,ApoC3蛋白在细胞中表达部位与PSORT II Prediction软件预测结果一致。本研究结果为进一步构建ApoC3基因转基因动物模型,开展ApoC3基因的多态性变化而导致的相关疾病研究奠定了基础。     

猪BST-2全基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析

为研究猪BST-2基因的生物学功能,用特异性的引物扩增猪BST-2基因,并利用生物信息学软件对猪BST-2基因及氨基酸进行分子特性分析,同时进行了猪BST-2蛋白的真核表达及组织表达谱分析。结果表明:猪BST-2基因全长851bp,其中5′-UTR为23bp,3′-UTR为294bp,CDS区为534bp,编码177个氨基酸,猪源BST-2蛋白氨基酸序列与大猩猩、仓鼠、家鼠、驴、猫、牛、猕猴、绵羊、人BST-2蛋白氨基酸序列同源性分别为46.1%,41.7%,39.5%,35.4%,42.0%,40.5%,44.4%,38.7%,46.8%。含有2个跨膜结构(27~49aa和154~176aa),2个潜在的糖基化位点,14个潜在的磷酸化位点,包含磷酸激酶ATM、CKⅡ、PKA、PKC的结合位点。构建真核质粒并转染发现猪BST-2蛋白能够在Vero细胞内正确表达。半定量PCR检测发现BST-2基因在所有组织中均有表达,尤其是在免疫组织及器官(淋巴结、胸腺、扁桃体、脾)、大肠、小肠中的表达量较高。本试验为今后进一步分析验证猪BST-2蛋白的抗病毒机制奠定了基础。     

猪CD8β基因的克隆、表达及其结构与功能分析

本研究应用RT-PCR技术,从猪胸腺细胞总RNA中扩增、克隆了猪CD8β基因,序列分析表明CD8β含621 bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,与NCBI/GeneBank已发表的参考基因的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分别为97.8%和96.8%,与人、小鼠和鸡CD8B蛋白的氨基酸同源性分别为75.7%、67.9%和33.3%.根据大肠杆菌密码子偏嗜性改造目的基因,构建了pET28a/PCD8 β原核表达系统,并经诱导获得高效表达的分子量为24 ku的重组蛋白(rPCD8 β),表达量占菌体蛋白总量的30%.利用生物信息学和分子生物学软件对猪CD8 β基因编码的蛋白进行结构预测,表明猪CD8 β成熟蛋白为跨膜蛋白,其中172aa在胞外区,22aa在跨膜区,10aa在胞内区;蛋白骨架内含有较多的柔性区域,而且分布不均匀.能形成结构松散的球状蛋白;猪CD8 β分子V区三维结构与鼠的具有非常相似的空间结构,与人的差别较大,这为猪CD8B蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础.     

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

野生与家养乌苏里貉FSHβ和FSHR基因的克隆及序列分析

对野生和家养乌苏里貉的FSHβ基因部分序列、FSHR基因5'端上游调控区和外显子10进行扩增和测序,获得序列长度分别为1257、757和1398 bp,提交GenBank,登录号分别为HQ385977、HQ385978和HQ385979。BLAST比较分析3段序列外显子区,与犬的同源性分别为99%、98%和98%。利用DNAMAN软件对2只野生与2只家养貉进行多序列比对,结果分析,3个基因片段中分别检测到12、10和3个变异位点,其中编码区碱基的突变位点分别有2、1和0个;将2只野生貉的序列相比较,发现3段序列分别有6、9和3个多态位点,而将2只家养貉的序列相比后分别有2、1和0个多态位点,说明野生貉更具有遗传多样性。     

猪类无精症缺失基因DAZL的cDNA全长克隆、组织表达和亚细胞定位

旨在获得猪类无精症缺失基因DAZL cDNA全长序列,阐明该基因的序列、mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征及亚细胞定位情况.本研究以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)10月龄成年公猪为研究对象,屠宰收集组织样,利用RACE和RT-PCR技术获得DAZL基因cDNA全长序列...     

人IL-3、GM-CSF和Hly基因的cDNA克隆及测序

试验利用PCR技术扩增并获得了人IL-3、GM-CSF和人溶菌酶(human lysozyme,Hly)基因组基因编码区序列,人IL-3和GM-CSF基因PCR产物与pMD19-T连接,Hly基因PCR产物同pEASY-Blunt载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,蓝白斑筛选后经PCR及酶切鉴定,选取测序正确的克隆连接到pIRESneo载体中构建相关真核表达载体,分别用这些基因的表达载体转染PK15细胞,48 h后提取转染细胞的总RNA,并采用RT-PCR方法获得了人IL-3、GM-CSF和Hly基因的cDNA,结果发现,所获得的cDNA序列同NCBI登录的序列完全同源。     

东串猪Mx1基因第14外显子多态性及组织表达谱分析

为了揭示抗黏液病毒1（myxo-virus resistance 1,Mx1）基因第14外显子在东串猪群体中多态性分布及组织表达特性,试验利用PCR-RFLP技术测定东串猪Mx1基因第14外显子的多态性,同时利用实时荧光定量PCR技术分析其组织特异性表达规律。结果表明,东串猪Mx1基因第14外显子Hin6Ⅰ酶切位点存在G36T突变,可检测到AA、AB、BB 3种基因型,AB为优势等位基因型,A为优势等位基因;东串猪Mx1基因的多态信息含量（polymorphism information content,PIC）值为0.360,表现为中度多态;Mx1基因在淋巴、肺脏、脾脏、十二指肠、空肠、回肠组织中表达量较高。本研究初步揭示了东串猪Mx1基因第14外显子的多态性分布,为探讨其作为有效遗传标记的可行性提供参考。此外,Mx1基因在多种免疫组织中高表达,可能与机体抵抗病原感染有关。     

ICR小鼠Mxl基因的克隆及组织表达

为了对ICR小鼠的Mxl基因序列特征进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律,用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导小鼠腹腔巨噬细胞,应用RT-PCR技术克隆小鼠Mxl基因全长编码区序列,并用半定量RT-PCR方法研究该基因在组织中的特异性表达规律.结果显示,从雌性ICR小鼠腹腔巨噬细胞中克隆的Mxl基因的CDS...     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

猪FoxO1基因cDNA部分序列的克隆及其组织表达

根据人、黑猩猩及大鼠等物种FoxO1基因同源序列设计引物,利用RT-PCR方法从猪肝脏中克隆FoxO1基因cDNA的部分序列,组织特异性表达分析表明,FoxO1基因在1日龄和9月龄猪的肝、肺、肾、脾、心、胃、皮下脂肪、内脏脂肪、背最长肌和股四头肌等组织中均表达,只是表达丰度随发育阶段和组织的不同有所差异。1日龄猪的内脏脂肪中FoxO1的表达丰度最高,心脏和骨骼肌中相对较低;而9月龄猪的脾脏中FoxO1相对表达丰度最高,明显高于免疫机能尚未完全建立的初生猪,显示出FoxO1可能在机体的免疫调节中起一定作用,另外,9月龄猪的FoxO1表达丰度不仅在平滑肌和骨骼肌中有显著差异,而且在不同类型的骨骼肌中也存在显著差异,显示出FoxO1的表达可能与骨骼肌类型和运动强度有关。     

猪RPS3基因的克隆和表达分析

RPS3在体内具有多种功能,为了进一步揭示其结构与功能的关系,探索其编码区作为系统发育标记的可行性,本研究应用生物信息学、RT-PCR和3-′RACE方法首次克隆了猪RPS3基因（GenBank登录号：DQ660373）并进行了序列分析,同时利用半定量RT-PCR方法分析了RPS3基因的时空表达规律。序列分析表明RPS3开放读码框全长为732 bp,编码243个氨基酸残基的多肽链,含有核糖体蛋白S3标签,构建的系统发育树显示聚类结果与动物学上的分类一致。半定量RT-PCR分析表明RPS3在所检测的10种组织中均有较高水平的表达,心脏中的表达量最高,肺脏中的表达量最低,其它组织间差异不大;在仔猪中表达量高,随着日龄的增加表达量不断下降,在3月龄以后的猪中表达量趋于平稳。以上结果说明RPS3基因CDS适合构建种间的系统发育树,mRNA的表达水平与细胞的生长代谢速度有关。     

山麻鸭OC-116基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

实验旨在探究OC-116(Ovocleidin-116)基因在山麻鸭蛋壳形成过程中的作用,应用SMART-RACE技术克隆获得了长度为2129 bp的山麻鸭OC-116基因cDNA全长序列,运用生物信息学软件对该基因和蛋白的特征进行分析,结果显示:该基因编码蛋白的分子式为C2710H4331N865O927S12,属于...