犬瘟热病毒H、F、N基因试验免疫研究

以构建的真核表达载体pVAXLPH、pVAXLPF和pVAXLPN为基因疫苗,分组进行了免疫小鼠试验,对免疫鼠体内免疫应答水平进行了检测。结果显示:所构建的基因疫苗可以诱导小鼠产生特异性免疫应答反应,pVAXLPH pVAXLPF pVAXLPN 3个基因混合免疫小鼠诱导产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答,免疫3次后血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.332,而免疫前为0.158;抗CDV中和抗体效价为1∶(4~16);CD4 T/CD8 T比值为2.05±0.38,而对照组为1.99±0.56;免疫小鼠脾细胞对CDVLP及ConA刺激的增殖反应值分别为0.384和0.356。基因疫苗免疫犬试验中,进行了单用基因疫苗免疫和基因疫苗与CDV弱毒疫苗联合免疫效果的比较研究。结果显示,基因疫苗免疫3次后,血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.296,抗CDV中和抗体效价为1∶(8~32)。基因疫苗免疫2次,再使用弱毒疫苗加强免疫1次,血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.433,抗CDV中和抗体效价为1∶(16~64)。     

北京地区犬瘟热病毒分离株H基因的分型

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考毒株Onderstepoort的序列设计了一对引物,以感染犬瘟热病毒的犬的粪便总RNA为模板,RT-PCR扩增出17株CDV的H全基因1877bp的片段,将这个片段连接到pGEM-Teasy载体上,经酶切鉴定得到阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,并与国内外毒株进行同源性比较和系统发育分析,结果显示17株均为Asia-1型。北京地区流行的毒株主要是America-1型和Asia-1型,其中2007年主要流行America-1(疫苗型),而2008年主要是Asia-1型。     

犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。     

犬瘟热病毒SH株N蛋白基因序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,以CDV SH株的总RNA为模板,RT-PCR扩增N蛋白基因,并进行克隆与序列分析.结果显示:CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、 A75/17 株、2 544/Han95株、98～2 654 株、5 804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%,97.6%,96.7%,96.9%,96.6%,93.9%;编码氨基酸的同源性分别为99.0%,98.7%,98.1%,97.9%,97.9%,96.9%.推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白.     

犬瘟热病毒SH株N蛋白基因序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,以CDV SH株的总RNA为模板,RT-PCR扩增N蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示:CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、A75/17株、2 544/Han95株、98~2 654株、5 804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%,97.6%,96.7%,96.9%,96.6%,93.9%;编码氨基酸的同源性分别为99.0%,98.7%,98.1%,97.9%,97.9%,96.9%。推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

犬瘟热病毒贵州分离株N基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株N蛋白基因序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的N基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株N基因的ORF全长1572 bp,其编码氨基酸序列与国外Shuskiy株和01-2689株的同源性分别为98.9%和97.1%,与部分国内分离株同源性在95%以上,说明N蛋白是保守性较强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287 bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%~96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%~99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。     

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒免疫原性测定

为测定表达犬瘟热病毒(CDV)H基因的重组犬2型腺病毒(CAV-2/CDVLPH)免疫原性,25只45-50日龄犬(抗CDV中和抗体小于1∶2,CAV-2 HI抗体效价小于1∶2)随机分为5组进行免疫犬试验,第1组为CAV-2/CDVLPH免疫组,第2组为pVAXLPH免疫组,第3组为pVAXLPH和CAV-2/CDVLPH联合免疫组,CDV弱毒疫苗组和pVAX1空载体组分别作为阳性和阴性对照组。利用间接ELISA和CDV中和试验检测免疫犬的抗CDV体液免疫水平、CAV-2 HI试验检测免疫犬的抗CAV体液免疫水平、淋巴细胞转化试验检测免疫犬的抗CDV和抗CAV-2细胞免疫水平,分析CAV-2/CDVLPH的免疫性。结果,能够在各试验组免疫犬血清中检测到抗CDV ELISA抗体和抗CDV中和抗体,同时在第1组和第3组免疫犬的血清中检测到抗CAV-2的HI抗体,免疫犬的外周淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显增殖,第2组的免疫应答水平低于第3组,第1组又高于第3组,但低于CDV弱毒疫苗免疫组,试验表明CAV-2/CDVLPH可同时诱导免疫犬产生抗CDV和CAV特异性免疫,CAV-2/CDVLPH与pVAXLPH相比能诱导犬产生较高的特异性免疫应答,然而低于CDV弱毒疫苗。     

嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒（CDV）血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒（RABV）,并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG （H）。将pHEP-dG （H）与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG （H）。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG （H）中稳定遗传和正确表达。HEP-dG （H）在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG （H）的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数（MOI）为0.005感染BHK细胞,HEP-dG （H）的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG （H）与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG （H）对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG （H）与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平（0.5 EU/mL）;此外,HEP-dG （H）可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG （H）与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG （H）,其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。     

小熊猫源犬瘟热病毒株H、F基因的克隆及序列分析

为了解1株圈养小熊猫源犬瘟热病毒(CDV) GD-1的遗传变异情况,通过RT-PCR方法对该株CDV进行H、F基因的克隆、测序及序列分析.结果 显示:该分离株的H基因序列与GenBank中丹麦报道的登录号为GU266280的犬源CDV毒株的核苷酸序列相似性最高,为96％;F基因序列与巴西报道的登录号为KY057355的...     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体     

基于H蛋白基因的犬瘟热病毒遗传变异分析

犬瘟热是犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染犬和其他食肉动物造成的多发性、致死性传染病,本文从分子水平上探讨CDV遗传进化特性、变异情况与流行规律之间的关系.通过收集2002-2010年在中国地区分离的14株CDV野毒株、2006-2007年在全球各地分离的12株CDV野毒株以及从不同宿主分离的12株CDV野毒株和4株疫苗株,将其分为4组,将前3组野毒株分别与国内外正在使用的4株疫苗株的H基因进行遗传变异分析.分析发现,CDV野毒株与疫苗株间H蛋白基因的核苷酸相似性为86.2％～92.1％,其氨基酸相似性为89.1％～91.9％;H基因的584位的天冬酰胺糖基化位点是Asia-Ⅰ型CDV所特有的;H蛋白3555区域的非同义氨基酸替换概率较高.作者推测H蛋白抗原变异可能造成弱毒疫苗免疫效力降低,不能为某些CDV株的感染提供完全有效的保护.     

犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）遗传变异情况,本研究采用首尾重叠的11对特异性引物,对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增,将扩增片段进行反复测序,序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列,应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,SH202003株基因组全长为15 690 bp,编码6种结构蛋白（N、P、M、F、H和L）,H和L基因间隔序列为CUA,L和5'端尾随序列为CAA,与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高,达到98.6%和96.6%,与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%,氨基酸相似性只有82.7%~87.0%;全基因进化树中,SH202003株与流行野毒株在同一分支,与疫苗株在不同的分支;H基因同样与Hebei株亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%,与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远;SH202003株处于Asia-1型分支,属于Asia-1型强毒株;SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点,与强毒株Hebei株一致。研究表明,上海株SH202003属于CDV强毒株,为Asia-1型,其H基因序列相对保守,具有9个潜在N-糖基化位点,但是全基因序列存在较多突变,与疫苗株的匹配度较差,可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。