花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

构建了大麦黄矮病毒GPV株系串联结构复制酶基因植物表达载体pPPI29,通过花粉管通道法转化了CA8686小麦,对T₀代种子进行了分子检测,获得6株转基因小麦,转化率达到0.45%;对获得的T0代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定,结果表明4株转基因小麦对GPV株系表现为高抗,可以推迟发病23 d。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1的小麦植株

 以生产用4种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1分别转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出15株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF1已经整合到小麦基因组中,共获得14株转基因植株。抗病性初步检测结果显示,转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,对于不同的基因型小麦进行转化时,需选择适合本基因型的菌株。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2小麦植株

以生产用5种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出9株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF2已经整合到小麦基因组中。初步抗病性检测结果显示转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,受体基因型、外植体的生理状态对农杆菌侵染起着至关重要的作用。     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。     

大麦黄矮病毒(BYDV) cDNA的合成、克隆及初步应用

 以大麦黄矮病毒二叉蚜和麦长管蚜专化株的病毒核酸为模板,以小牛胸腺DNA为引物,合成cDNA的第一条链,再用缺口翻译法合成第二条链,然后采用加装BamH₁人工接头的方法将ds-cDNA插入到质粒载体pUC₈中,重组质粒于大肠杆菌JM—83中进行克隆,以克隆的颜色变化选择含有外源DNA的克隆,再用病毒核酸制备的探针筛选真正病毒cDNA插入的克隆。重组质粒中ds-DNA的插入长度在300—1600bp之间。用缺口翻译法制备质粒DNA分子探针检测同源病毒液,反应灵敏度在100pg-1ng之间。应用cDNA探针检测不同病毒和病毒株系,从中筛选出黄矮病毒株系专化克隆系,黄矮病毒专化克隆系和黄矮病毒组专化克隆系.     

晋南冬麦区大麦黄矮病毒流行株系监测及防治策略探讨

连续5年(1996～2000年)采集晋南冬麦区小麦黄矮病标样,采用生物学和血清学(酶联免疫吸附法)相结合的诊断方法对该地区的大麦黄矮病毒流行株系进行了鉴别。结果表明,该小麦黄矮病流行区近五年以GAV株系为主流株系,兼有少量GPV、PAV和混合株系存在。同时对小麦抗黄矮病新品种“临抗1号”进行了GPV和GAV两种株系的抗性测定,明确了该品种兼抗GPV和GAV两种株系。根据小麦黄矮病发生现状,提出了一套以选育推广抗耐病品种为主,以药剂防治为辅的综合防治措施。以期为当地小麦生产服务。     

水稻抗病基因Xa21转入3个粳稻品种的抗性初步分析

 通过农杆菌介导转化,将已克隆的水稻白叶枯病抗性基因Xa21转入我国辽宁省3个粳稻品种:沈农606、辽粳454、辽粳294,共获得独立转基因系205个。通过PCR、GUS染色和Southern blot分析,证明Xa21基因已经整合到3个粳稻栽培品种的基因组中。通过温室接种菲律宾白叶枯病小种6的代表菌系PXO99,T₀代转基因水稻除了3-34表现部分抗性外,其它的转基因材料均表现高度抗病,表明Xa21转基因水稻已经获得抗性;温室接种T₁和T₂代试验表明,单拷贝整合的转化体呈现3:1分离,同时单拷贝3-34材料也表现部分抗性和感病3:1分离,证明已整合的Xa21基因能稳定遗传;同时对3-34部分抗性机制进行了分子生物学检测,证明GUS基因全部丢失、Xa21基因部分丢失并导致部分抗性。获得部分抗性材料,对于深入研究Xa21基因的功能区和研究抗病分子机制具有重要的意义。     

抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育

 以大白菜栽培品种"福山大包头"的子叶柄为供试材料,对影响大白菜植株再生和基因转化频率的因素进行了研究。在此基础上,建立了大白菜高效再生体系和有效的基因转化体系,并将芜菁花叶病毒的CP基因(TuMV-CP)导入大白菜中,获得转化植株。PCR检测和Southern杂交分析证明TuMV-CP基因已整合于大白菜的基因组中;Northern杂交分析及EL ISA检测表明TuMV-CP基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。转基因植株T1代的遗传分析表明,外源基因在转基因植株后代中遵循3:1的分离规律。抗病性测定结果显示,转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

Complementation of coat protein mutants of pepper huasteco geminivirus in transgenic tobacco plants

ABSTRACT The role of the pepper huasteco virus (PHV) coat protein (CP) gene during the infection was investigated in three different hosts by using mutations that produced truncated proteins and by complementation assays in transgenic plants. The infectivity analysis revealed that mutants that express truncated CP (CP7 and CP191) behave like the wild-type virus when inoculated onto pepper and Nicotiana benthamiana plants in terms of symptom expression and viral DNA movement. On the contrary, the CP7 mutant was unable to systemically infect tobacco plants, whereas only 10% of the plants inoculated with the CP191 mutant became infected. The CP7 mutant was complemented by coinoculating it with another geminivirus (taino tomato mottle virus). No complementation was observed in plants from nine transgenic tobacco lines expressing CP under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. However, 3 out of 10 lines expressing CP under the control of its own promoter (693 nucleotides) were able to complement the CP7 mutant. Interestingly, upon infection, the levels of CP mRNA in 693CP plants increased dramatically, probably due to transactivation of the CP promoter by the viral protein AC2.     

hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3'端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4:1、2:1和1:1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1:8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。     

马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究

 本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)外壳蛋白(CP)基因(PVY^N CP)5'端和3'端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKⅡ-5'IR和pROKⅡ-3'IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVY^N CP基因3'端茎50 bp(环50 bp) hpRNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVY^N CP基因5'端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVY^N CP基因的3'端比5'端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。     

表达dsRNA的细菌提取液可抑制黄瓜花叶病毒对烟草的侵染

 利用RT-PCR分别克隆了CMV P3613株系的RNA2片段、MP(movement protein)基因片段及CMV AN株系的CP(coat protein)基因片段。以CP基因为中间间隔序列,分别构建了含有RNA2片段和MP基因反向重复片段的原核表达载体。体外转录试验表明:两个载体转录后都能形成预期大小的dsRNA。经过IPTG诱导,在大肠杆菌HT115(DE3)菌株中可表达产生预期大小的核酸片段,经DNase和RNaseA消化处理,证实为dsRNA。将表达病毒基因dsRNA的细菌超声破碎后处理烟草,进行保护和治疗试验,结果表明:表达CMV MP基因和RNA2片段dsRNA的细菌破碎液能够诱导烟草对CMV产生抗性。接种病毒60d后,保护效果试验病株率分别为45%和60%,治疗效果试验病株率分别为75%和85%,而其他对照发病率均为100%。本研究结果证明了利用RNA沉默的原理,构建具有反向重复序列的原核表达载体,用细菌表达dsRNA的粗提取物可防治CMV对烟草的侵染。     

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

 为探索核基质结合区(matrix attachment regions,MARs)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM2CPNTM2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM2CPNTM2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MARs转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。