茉莉花萜类合成酶基因JsTPS的克隆及其表达分析

以双瓣茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆了萜类合成酶基因（JsTPS）的全长cDNA,该cDNA全长为1 884 bp,其中ORF为1 491 bp,编码496个氨基酸的蛋白,分子量56 989.7 D,与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与油橄榄（Olea europaea）的TPS2具有75%的同源性,同属于α-Farnesene synthase分支。采用荧光定量PCR技术检测JsTPS在茉莉花开放过程中的表达量变化,结果表明,表达量在未开放时（18：00）最低,在半开放时（22：00）达到最高。     

茶树萜类香气物质代谢谱与相关基因表达谱时空变化的关系

针对影响茶叶香气品质的关键物质在鲜叶和花中的含量和相关基因表达的关系,以茶‘农抗早’[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze‘Nongkangzao’]不同发育阶段鲜叶和花为试材,进行气相色谱和质谱分析。结果表明,茶树叶片萜类化合物含量受叶片发育阶段影响,表现为幼叶中多、老叶中少;糖苷态多、游离态少。此外,对前期获得并初步注释的茶树转录组数据库进行挖掘,发现了编码10个萜类合成酶--芳樟醇合成酶（CsLIS）、香叶烯合成酶（CsMYS）、(E)–β–罗勒烯合成酶（CsOCS）、(R)–柠檬烯合成酶（CsLIM）、(–)–α–萜品醇合成酶（CsTES）、(+)–α–水芹烯合成酶（CsPHS）、大根香叶烯合成酶（CsGES）、(E,E)–α–法尼烯合成酶（CsFAS）、芳樟醇/橙花叔醇合成酶（CsLIS/NES）和橙花叔醇/香叶烯芳樟醇合成酶（CsNES/GLS）的基因序列（按照植物基因命名的基本原则对上述基因进行命名）。上述基因在不同发育阶段叶片和茶树花中的转录水平与萜类香气物质丰度的时空变化有明显的正相关。此外,逆境信号物质茉莉酸甲酯能显著增强芳樟醇合成酶基因等6个基因的表达。     

植物萜类合成酶及其代谢调控的研究进展

 萜类是植物中一类重要的次生代谢物,具有重要的生理生态作用及经济价值。萜类合成酶是萜类化合物形成的关键酶,包括单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等,其种类和功能决定了萜类的多样性。萜类合成代谢具有明显的组织特异性,并受植物发育进程的调控,外界生物与非生物因子对其代谢有显著影响。基因工程技术在一定程度上改变了转基因植株中萜类的组分和含量。综述了近年来在萜类合成酶结构、分类和作用机理以及萜类代谢调控的研究进展。     

千层金MbEGS基因的克隆与功能分析

在前期构建的千层金（Melaleucabracteata）转录组数据库中鉴定并克隆得到2个丁香酚合成酶基因MbEGS1和MbEGS2,基因编码区（codingsequences,CDs）序列长度分别为963和972bp,分别编码320和323个氨基酸。序列比对和系统进化树分析表明,MbEGS1、Mb EGS2与仙女扇（Clarkia breweri）CbIGS1蛋白序列相似性最高,达到65.92%和63.89%。qRT-PCR分析表明,二者在千层金的花、叶片和茎中均有表达,其中在花中表达量最高,叶中次之,茎中最低,与不同组织中丁香酚含量的变化类似,基因表达量与丁香酚含量呈显著正相关;MbEGS1在千层金的根中有表达,且表达量高于茎段,但低于叶片,而MbEGS2在根中不表达。采用不同浓度MeJA处理千层金发现,MeJA能够诱导MbEGS1和MbEGS2表达和丁香酚合成,0.1 mmol·L-1 MeJA诱导效果最显著,其转录水平与丁香酚含量呈正相关。亚细胞定位结果表明,Mb EGS1主要定位于细胞质膜和细胞核中,Mb EGS2主要定位于细胞质膜中。在森林草莓中异位表达MbEGS1和MbE...     

环烯醚萜类成分生物合成途径及关键酶基因探究

环烯醚萜类成分为广泛分布于中药中的次级代谢产物,经常出现在龙胆科、唇形科、茜草科、玄参科中。由于它是一种结构为半缩醛及环戊烷的单萜类化合物,所以性质不稳定,以苷类形式存在于植物中。环烯醚萜类成分因其特殊结构和多元药理活性,广泛应用于临床抗肿瘤、抗炎、降血糖等方面研究。重点分析环烯醚萜类成分生物合成途径以及其关键酶基因,以期为深层次挖掘环烯醚萜类功能基因以及生物合成途径解析提供参考。     

菊花花瓣伸长相关基因CmXTHs的克隆与功能验证

从杭白菊(Chrysanthemum morifolium‘Hangbaiju’)中克隆了4个细胞壁松弛和伸展相关的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因,分别命名为CmXTH1、CmXTH2、CmXTH3和CmXTH4,序列分析表明其编码的氨基酸序列N端都含有23~30个氨基酸组成的信号肽区域和保守的催化活性位点DE(I/L)DEFLG以及紧邻的N(R/A)T组成的N端糖基化位点,CmXTH1/2/3的C端均含有4个保守的半胱氨酸残基,CmXTH1/2/3/4蛋白的相似度为66.2%。系统进化分析结果表明,CmXTH1/2/3属于XTH家族Ⅰ组,CmXTH4属于Ⅱ组。实时荧光定量结果表明:(1)菊花CmXTH1/2/3/4在根、茎、叶和花蕾中均有表达。CmXTH1在根中表达量较高,CmXTH2/3在茎中表达量较高,CmXTH4在花蕾中表达量最高。(2)CmXTH1/2/3/4在花序不同部位表达量有差异,CmXTH1/4在舌状花中表达量最高,CmXTH2/3在筒状花中表达量较高。(3)CmXTH1/2/3/4在舌状花不同发育阶段表达量差异显著,CmXTH1/2在盛花期表达量最高,CmXTH3在衰老期表达量最高,CmXTH4在初开期表达量最高。病毒诱导基因沉默结果表明,CmXTH1/2/3/4沉默系的花序直径和舌状花长度与对照相比均有所减小,其中CmXTH4沉默系减小最大,分别减小了25.67%和10.42%,舌状花花瓣表皮细胞与对照相比明显变小,影响了舌状花花瓣的伸长;CmXTH2沉默系的筒状花雄蕊长度和CmXTH4沉默系的花萼直径分别与对照相比显著减小。这表明菊花CmXTH1/2/3/4基因参与了花序的开放,促进了舌状花花瓣的伸长,对于菊花的花序增大具有重要作用。     

菊花脂肪酸脱饱和酶基因CmFAD7的克隆与表达分析

以秋菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆了ω-3脂肪酸去饱和酶基因,命名为CmFAD7,GenBank登录号为KC567246。该基因cDNA 全长1 284 bp,编码428个氨基酸,相对分子量为48.98 kD,等电点为9.07,编码的氨基酸序列与高山还阳参同源性最高（84%）。该蛋白含有?12-FADs保守结构域和3个跨膜螺旋,N端含有一段叶绿体转运肽,属于膜脂肪酸去饱和酶超级家族。采用实时荧光定量PCR和气相色谱法研究低温胁迫下叶片和根系中CmFAD7的表达量及脂肪酸含量变化,CmFAD7在根系和叶片中均有表达,叶片中的表达量高于根系。根系中5 ℃时表达量最高,叶片中–4 ℃时最高,在–8 ℃时叶片和根系表达量均较低;随着处理温度的降低,叶片中C18:3含量呈逐渐上升趋势,根系中变化不明显。结果表明,菊花CmFAD7与抗寒性有关,低温条件下不同器官的表达量有较大差异。     

桂花C4H基因的克隆与表达特性分析

利用转录组测序获得的表达序列信息,结合RACE技术,从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其ORF全长分别为1 518 bp和1 611 bp,各自编码505和536个氨基酸,命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。系统进化树表明,OfC4H1与矮牵牛中的PhC4H1、PhC4H2等C4H蛋白聚为一类,属于Class Ⅰ类型;OfC4H2与金银花中的LjC4H等属于ClassⅡ类型。进一步的C4H蛋白序列多重比较发现,OfC4H1和OfC4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域,在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式,结果显示,OfC4H1在花瓣中的表达量最高;OfC4H2在花瓣中的表达量较低,在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs,转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明,目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达,而且与预期大小一致,但因溶解度较低无法进行酶活性分析。     

菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

以菊花（Chrysanthemum morifolium）免疫白色锈病品种‘C029’为试验材料,基于白色锈病病原菌诱导的菊花转录组数据库,采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆得到菊花DREB（Dehydration responsive element binding protein）基因,命名为CmDREBa-2。对其进行生物信息学分析和表达分析,结果表明：CmDREBa-2开放阅读框（ORF）全长291 bp,编码96个氨基酸;预测CmDREBa-2蛋白相对分子质量为11 159.04,pI为11.34,是一个定位于细胞核、亲水的不稳定蛋白;氨基酸序列和结构分析显示该蛋白含有1个由49个氨基酸残基组成的AP2保守结构域,所以该蛋白属于AP2/EREBP家族;进化树分析表明CmDREBa-2属于DREB家族的A-1组,CmDREBa-2蛋白与菊花的其他两个DREB类蛋白CmDREBa和CmDREBb的同源性较高;菊花‘C029’接种白色锈病病原菌6 h后,CmDREBa-2表达量达到最高,约为未接菌对照的34倍;用水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）处理‘C029’菊花叶片,结果表明CmDREBa-2受3种激素的诱导表达。     

柑橘SQS基因的克隆及功能分析

从18个柑橘品种中克隆角鲨烯合成酶(squalene synthase,SQS)基因,分析其序列和表达特性,通过遗传转化研究该基因在柑橘类柠檬苦素生物合成过程的作用。结果表明,除了‘融安金柑’和‘小果罗浮’外,SQS基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 242 bp,编码413个氨基酸。序列比对发现,18个品种的氨基酸序列保守性为97.1%～100%,‘小果罗浮’‘融安金柑’和‘4号宜昌橙’等品种在CDS区第14位碱基发生G/C非同义突变。系统进化树显示,‘小果罗浮’‘融安金柑’和‘4号宜昌橙’的SQS具有较近的遗传距离。qRT-PCR结果表明,柑橘SQS基因在花中的表达水平最高,成熟茎中其次,幼嫩茎、根和叶片中再次,幼果中最低。‘琯溪蜜柚’不同发育时期种子中SQS基因表达水平与类柠檬苦素含量呈极显著正相关。4株SQS基因干扰的‘锦橙’株系(SiN-1～SiN-4)叶片中的SQS基因表达水平为对照的61.00%～79.00%;柠檬苦素含量为对照的35.83%～81.56%;SiN-1和SiN-2叶片中的诺米林含量分别为对照的80.11%和94.94%,而...     

白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达

以白姜花的叶片为材料,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆到一个倍半萜合成酶基因的cDNA序列,其全长为1 932 bp,基因编码区共1 653 bp,编码551个氨基酸,命名为Hc-Sesqui。该基因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性,并且含有DDXXD保守序列。通过Clustal.X进行序列分析,确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-a亚族。Northern杂交的结果表明,该基因在茎、叶和萼片中均有表达。     

毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的克隆及组织表达谱分析

根据物种间同源基因设计引物,对构建好的毛竹笋全长cDNA文库进行大规模PCR筛选,成功分离出了毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的cDNA序列,全长共3 545 bp（GenBank登录号：FJ799713）。该序列包含3 243 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 081个氨基酸。通过核酸序列比对发现,该序列与绿竹、水稻、玉米、小麦和大麦的纤维素合成酶基因同源性极高（> 90%）。蛋白序列比对分析发现：PeCesA蛋白含有植物纤维素合成酶特有的保守区、可变区、N端Zn指结构域以及8个跨膜区;系统发育分析表明PeCesA与绿竹BoCesA4、水稻OsCesA4、玉米ZmCesA4属于同一进化分支。运用实时定量PCR法分析PeCesA基因的组织表达特异性发现,PeCesA在毛竹根部的表达量最高,茎部其次,叶中较少;在竹笋基部的表达量远远高于竹笋上部。随着PeCesA基因表达量的增高,组织中的纤维素含量亦相应增高。推测PeCesA参与了毛竹次生细胞壁中纤维素的生物合成。     

观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析

 以观赏桃品种‘红雨垂枝’为试材,采用SON-PCR方法从叶片中快速获得了查尔酮合成酶基因全长序列,命名为PphCHS,GenBank登录号为JN391444,其长度为2353 bp,具有一个1140 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码379个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,PphCHS与已报道的其他植物的CHS推导的氨基酸序列具有高达90%以上的相似性;氨基酸聚类分析表明：观赏桃首先与樱桃李聚类,其次与草莓。生物信息学分析表明：PphCHS蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列RLMMYQQG CFAGGTVLR,不含信号肽序列。     

菊花FT类似基因的克隆与表达分析

以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）‘七月桃花’为材料,利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了光周期调控开花重要基因FLOWERING LOCUS T（FT）的类似基因（基因登陆号GQ925916,命名为CmFT）。该基因开放阅读框有525 bp,可编码174个氨基酸。蛋白比对发现,CmFT所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序和两个关键性氨基酸残基。通过系统遗传进化树分析进一步表明CmFT属于FT亚家族成员。SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析结果表明CmFT在花芽的表达量最高,茎的表达量次之,叶片表达量最低。在短日条件下,该基因的表达量呈昼夜节律表达型,在光照期间呈下降趋势,在夜间逐渐上升,光照前4 h时达到最高水平。在长日条件下,其相对表达量显著低于短日条件下且趋于零。由此推测,该基因主要与菊花光周期敏感性密切相关,可能在光周期促进开花中发挥一定的作用。     

切花菊再生株的形态和细胞学变异的研究

以切花菊新品种金潮和５９－１９品系为试材，以带有腋芽的茎段为外植体，两种基因型的再生株与各自的对照在主要性状上无显著差异，用幼蕾培养时，再生株的变异则随品种而异，５９－１９的再生株表现稳定，而金潮的再生株除叶形指数外，几乎所有观察的性状都发生了变异，随继代时间的延长，变异程度有所增加，细胞学观察表明，金潮的幼蕾再生株中染色体数小于５４条的各种非整倍体比例显著增加；减数分裂期观察到落后染色体，微核等     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。