枇杷果实DHN基因克隆及其在低温胁迫下的表达分析

 以白沙枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）‘宁海白’幼果为试材,通过RT-PCR与RACE扩增,获得两个具有脱水素基因典型结构域特征的cDNA序列。其中DHN1（GenBank登录号：FJ472835）全长639 bp,编码188个氨基酸,属于Y2SK3类型;DHN2（GenBank登录号：FJ472836）全长858 bp,编码273个氨基酸,属于SK3类型。用低温胁迫处理枇杷幼果,–3 ℃处理24 h后电导率明显升高,表明细胞膜开始受到破坏,–6 ℃处理24 h后电导率显著高于–3 ℃处理。半定量RT-PCR和Western-blotting分析结果表明这两个DHN基因在低温胁迫下的枇杷幼果中都上调表达,表明其与枇杷抗低温胁迫有一定关系。     

三倍体枇杷花期调控基因Ej SPL5的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用同源克隆和c DNA末端快速扩增(RACE)技术从三倍体枇杷‘Q27’中分离得到1个调控花期的SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)转录因子家族基因EjSPL5。该基因cDNA序列全长为778 bp,其中5′非翻译区(UTR)序列为24 bp,3′UTR序列为214 bp,包含1个长为549bp的开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸。蛋白序列比对分析表明,EjSPL5和苹果、拟南芥及金鱼草的SPL蛋白序列具有较高的相似性,均具有保守的SBP结构域和核定位信号(NLS)。分子系统进化分析表明,EjSPL5与苹果MdSPL5具有较高的同源性,聚为同一分支。EjSPL5的亚细胞定位发现,其行使功能区域定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,EjSPL5在枇杷萼片和幼果中的表达量较高;二倍体和三倍体枇杷的早、晚花品种中EjSPL5表达量存在显著差异,其表达主要集中在花发育的前6个时期,在花蕾露白期和盛花期的表达量较低。三倍体枇杷EjSPL5表达量在花芽形态分化期最高,二倍体枇杷在花序侧生支轴快速伸长期的表达量最高。早花枇杷品种的EjSPL5相对表达量高于晚花品种。     

龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

枇杷ASR基因分离及其在果实发育中的表达分析

分离了枇杷ASR(abscisic acid,stress and ripening-induced)cDNA全长基因EjASR1,该基因长为877bp,含有1个822bp的开放阅读框,编码241个氨基酸。EjASR1基因编码的蛋白质与荔枝、甜橙亲缘关系较近,与水稻等亲缘关系较远。荧光定量RT-PCR分析显示,EjASR1表达量随着果实发育呈上升趋势,在果实发育后期EjASR1的表达量显著高于发育前期,表明该基因与成熟相关。     

杨树桑黄蓝光受体蛋白编码基因SvWC1的克隆及原核表达

对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)蓝光受体蛋白编码基因Sv WC1进行克隆及原核表达,并利用定量PCR方法研究菌丝体在不同光照时间(0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、11 h)处理后,Sv WC1表达情况.结果 显示:Sv WC1全长为3074 bp,含有一个2937 bp...     

切花月季ACC合成酶基因的克隆和原核表达

克隆了与伤害诱导相关的Rh-ACS1和与花朵开放进程及乙烯诱导相关的Rh-ACS3基因全长。结果表明,Rh-ACS1基因全长为2 132 bp,开放阅读框（ORF）长度为1 476 bp,推定编码491个氨基酸。Rh-ACS3基因的全长1 734 bp,ORF长度为1 545 bp,推定编码514个氨基酸。对这两个基因编码的蛋白进行原核表达分析,结果显示,在37 ℃条件下,0.6 mmol · L-1 IPTG诱导3 h后,携带Rh-ACS1 ORF和Rh-ACS3 ORF的原核表达载体分别在大肠杆菌中诱导生成了大量分子量约为70和60 kD的蛋白质,其大小与根据基因序列预测的理论值相一致。     

应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

枇杷属植物3个新S基因鉴定及大渡河枇杷分类地位的新证据

【目的】鉴定枇杷属普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷3个种的S-RNase基因型,为利用其优良性状开展种质创新,以及大渡河枇杷分类地位的探讨提供科学依据。【方法】以苹果S-RNase基因高度保守区设计兼并引物对3个种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用BLASTn、BLASTx、DNAMAN和CLUSTALW软件进行同源性检索、序列比对和结构分析。【结果】从参试的3个种中共分离了4个S等位基因,分别为S2-RNase、S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase,其中S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,GenBank登录号分别为:MG765271、MG846012和MG812504。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因与苹果S-RNase基因的氨基酸序列结构相同,具有5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV)。此外,所获得的4个枇杷S-RNase基因电泳图谱及同源性和进化分析结果表明,大渡河枇杷可能为普通枇杷和栎叶枇杷的杂交后代。【结论】确定了普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷的S-RNase基因型分别为S2S26、S32S34和S26S32。大渡河枇杷S-RNase基因型及S-RNase的同源性和系统进化分析结果支持其可能为普通枇杷和栎叶枇杷杂交后代的结论。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析

利用RACE 技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到1 个细胞分裂素氧化酶基因cDNA全长,命名为RcCKX5。序列分析表明,RcCKX5 cDNA 全长1 815 bp,5′ UTR 104 bp,ORF 1 626 bp,3′ UTR85 bp,编码541 个氨基酸,具有CKX 家族典型的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK（细胞分裂素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示RcCKX5 与可可TcCKX5 亲缘关系最近,与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5 同源性较高。荧光定量PCR 分析表明,狗蔷薇RcCKX5 在其根、茎、叶、花、果实中均有表达,根中相对表达量最高,花和果实中相对表达量较高。在狗蔷薇类根体形成发育过程中RcCKX5 的相对表达量不断升高,21 d 时达到最高,随后稍有下降,表明其可能参与了类根体的形成。6-BA 处理结果表明RcCKX5 能够快速响应6-BA 的诱导,表达量显著上调,2.5 mg · L-1 6-BA处理120 h 时,RcCKX5 的相对表达量达到最高峰。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

羽衣甘蓝Exo70A1基因的分离及表达分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-b S13-b）为试材,从柱头中分离Exo70A1基因,命名为BoExo70A1,GenBank登录号为JF919716。BoExo70A1全长cDNA序列为2 184 bp,包含56 bp的5′非编码区,211 bp的3′非编码区和一个长度为1 917 bp的开放读码框（ORF）,对应编码一个含有638个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoExo70A1与油菜BnExo70A1、拟南芥AtExo70A1的一致性分别为99%和94%;BoExo70A1基因结构含12个外显子和11个内含子,内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU-AG规则;Southern杂交结果显示,BoExo70A1在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝;Northern杂交结果显示BoExo70A1在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中表达,而且在叶中的表达量最低。     

刺五加鲨烯合酶基因2 cDNA的克隆与蛋白结构分析

采用RT-PCR和RACE法克隆了刺五加鲨烯合酶基因2(squalene synthase gene 2,SS2)cDNA的全长序列(GenBank登录号:JN714465)。该序列全长1 463bp,其中5’端非翻译区长10bp,3’端非翻译区长208bp,开放阅读框长1 245bp,编码414个氨基酸。该蛋白具有1个Trans_IPPS_HH保守区域、2个鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异性识别区域及2个跨膜区。氨基酸序列比对结果表明,该蛋白与五加科其它植物SS的一致性均大于90%,与刺五加SS1的一致性为91.79%。