中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤–2’白藜芦醇含量高，并抗白粉病。以此为材料，利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因 VqSTS12 和 VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法进行遗传转化，分别获得 7 个 VqSTS12 和 5 个 VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量 PCR 分析发现，与野生型植株相比，转基因植株中芪合酶基因 STS 与下游白藜芦醇糖基转移酶基因 RSGT 表达量升高，与 STS 有底物竞争关系的查尔酮合酶基因 CHS 表达量降低。STS 的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现，转基因植株对白粉菌的敏感性降低，发病较晚，病情较轻，在转基因植株上部分孢子萌发受抑制，菌丝发育迟缓。转基因植株中 VqSTS12 和 VqSTS25 受白粉菌诱导表达：在接菌后 1 ~ 3 d 内表达量显著升高，随后略有下降，在 6 ~ 7 d 表达量再次上升。同时高效液相色谱（HPLC）检测到 STS 的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄拥有的 VqSTS12 和VqSTS25 及其表达的芪类物质具有抑制白粉菌的作用。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病的研究

利用同源克隆法得到抗白粉病的中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23的开放阅读框,并构建过表达载体;通过器官发生途径诱导不抗白粉病的欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织并采用农杆菌介导法对其进行转化;经过PCR检测和Western blot鉴定,获得了5株VqSTS11超量表达植株和3株VqSTS23超量表达植株;人工接种白粉菌发现,转基因植株中白粉菌菌丝生长速度慢,孢子萌发受到一定的抑制,并且转基因植株中芪合酶基因相对表达量升高,抗病相关基因表达上调,芪类物质含量积累增多。本研究结果进一步证明中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23对白粉菌具有抗性,‘丹凤–2’可以为改良欧洲葡萄品种抗病性提供抗病基因,作为抗病育种的资源。     

葡萄中盐诱导的R2R3-MYB 基因的筛选与表达分析

 以葡萄砧木‘1103P’为试材,筛选获得了4 个受盐强烈诱导的R2R3-MYB 基因,系统进化 分析表明其编码蛋白属于不同的拟南芥R2R3-MYB 亚组。该4 个基因在根、茎、叶和果实中呈组成型表 达,但具有不同的表达水平,尤其是VvMYB112 在葡萄根系中具有较高的表达水平。在4 个基因中, VvMYB112 能响应100 ~ 200 mmol · L-1 高盐处理。此外,VvMYB112 和VvMYB15 也能被聚乙二醇（PEG6000） 和低温诱导,而VvMYB107 和VvMYB87 对PEG6000 和低温不敏感或受其抑制。表明这4 个基因可能通 过不同的途径介导抗盐性。     

过表达香樟CcCBFb的烟草非生物胁迫抗性增强

为探究香樟Cc CBFb基因增强植株非生物胁迫抗性的功能,通过农杆菌介导法将该基因转入烟草中,经PCR和半定量RT-PCR技术鉴定阳性转基因株系后,对获得的T1代转基因无性系(T2和T4株系)以及野生型(WT)进行干旱(0、150、300和450 mmol·L~(-1)的甘露醇)、高盐(0、100、200和300 mmol·L~(-1)的Na Cl)、4℃低温、–4℃冰冻胁迫处理,结果显示:转基因烟草在干旱和高盐胁迫下,幼苗的存活率均高于野生型;经4℃低温处理后,转基因烟草植株的脯氨酸和可溶性糖含量均显著高于野生型植株,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型植株;经–4℃的冰冻处理6 h后,野生型和转基因T4株系植株叶片均出现不同程度的萎蔫,而转基因T2株系植株未出现不良现象。由此可见,过表达CcCBFb基因不但能够增强烟草的抗旱和抗盐性,而且能够显著增强抗寒性。     

芥蓝二氢黄酮醇4–还原酶基因BoaDFR的克隆与功能鉴定

以白花芥蓝‘四季粗条’为材料克隆了Boa DFR基因,Gen Bank登录号为MT472647,CDS序列长为1158 bp,编码385个氨基酸,与甘蓝型油菜、甘蓝和白菜等具有高度同源性。Boa DFR表达水平在芥蓝不同发育时期、不同器官中存在显著差异,随植株发育总体呈现先下降后上升的趋势,在幼嫩种子中表达量最高。芥蓝原生质体的亚细胞定位结果显示Boa DFR定位在细胞核上。构建了农杆菌介导的芥蓝瞬时过表达体系,将Boa DFR转入白花芥蓝‘四季粗条’和黄花芥蓝‘福州黄花’中,发现Boa DFR在两种芥蓝中均高水平表达,转基因植株叶片颜色明显变紫,花青素苷显著积累,总含量最高达461.43μg·g-1 FW,而野生型和转空载体芥蓝叶片中几乎检测不到花青素苷。通过HPLC在转基因植株叶片中共检测到8种花青素苷,均为矢车菊花青素苷,其中矢车菊–3–阿魏酰–丙二酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷占比最高。     

罗布麻eIF-5A基因功能

以罗布麻为试材,采用农杆菌介导法将罗布麻eIF-5A基因导入烟草,分别对正常生长条件和NaHCO_3胁迫下转AveIF-5A基因烟草和非转基因烟草的过氧化氢酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量进行测定,以期为罗布麻eIF-5A基因功能研究提供参考。结果表明:正常生长条件下,转AveIF-5A基因烟草和非转基因烟草POD活性和MDA含量差异不显著,转基因植株SOD活性显著高于非转基因植株;在NaHCO_3胁迫下,转AveIF-5A基因烟草POD活性和SOD活性均极显著高于非转基因植株,而MDA含量极显著低于非转基因植株。AveIF-5A基因过量表达可以提高转基因烟草的耐盐能力。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

脱落酸对南果梨色素及部分合成关键酶的影响

通过对南果梨花青素、叶绿素、类胡萝卜素含量及花青素合成部分关键酶苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-羟查尔酮异构酶(CHI)的测定,确定脱落酸诱导南果梨花青素与叶绿素、类胡萝卜素之间的动态关系,以及酶活性动态变化.研究脱落酸(ABA)处理对南果梨花青素含量及部分合成关键酶的影响,探索提高花青素含量机理.结果表明:花青素与叶绿素、类胡萝卜素呈显著负相关.PAL、CHI酶活性极显著提高.脱落酸处理南果梨树体极显著增加了果实花青素含量,花青素合成部分关键酶激活是花青素含量提高的原因之一.     

红果肉与白果肉杨梅花青苷和糖代谢途径的差异蛋白研究

 以红果肉杨梅‘大叶梅’和白果肉杨梅‘水晶’为研究材料,运用2-DE 和MALDI-TOF-TOF 质谱技术,比较分析两个品种成熟期果肉花青苷和糖代谢途径相关蛋白的差异表达,共获得41 个2 倍差 异表达蛋白,其中33 个差异蛋白得到质谱鉴定。与白果肉的‘水晶’相比,有3 个蛋白质在红果肉的‘大 叶梅’中特异表达,29 个蛋白质上调表达,1 个下调表达。将这些差异蛋白按照功能进行分类,大部分 涉及花青苷代谢（12%）、糖和能量代谢（30%）、蛋白质代谢（18%）、防御应答（15%）等生理过程。发 现花青素合酶（ANS）、苯基丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合酶11（CHS11）、二磷酸尿核苷葡萄糖︰类 黄酮3–O–葡糖基转移酶（UFGT）是花青苷合成密切相关的关键酶,这些酶在红果肉的‘大叶梅’中 明显上调表达;同时,还发现9 个糖代谢相关蛋白在红果肉的‘大叶梅’中也显著上调表达。花青苷和 糖代谢途径关键蛋白对杨梅果肉花青苷合成和颜色的形成起到重要作用。     

大花君子兰查尔酮合酶基因CmCHS的克隆及其功能验证

为研究大花君子兰(Clivia miniata)查尔酮合酶的结构及功能,基于前期构建的大花君子兰转录组数据库,对参与花青素合成的CHS基因家族进行鉴定和筛选。在大花君子兰中克隆得到4个CmCHS(CmCHS1～CmCHS4),其开放阅读框全长分别为1 173、1 170、1 173和1 173 bp,编码390、389、390、390个氨基酸。氨基酸序列比对分析证实,CmCHS具备该基因家族典型的保守结构域。进化树分析结果显示,4条CmCHS属于真实的CHS,编码蛋白属于Ⅲ型聚酮合成酶(PKS),亚细胞定位于细胞质和细胞核中。基因表达特异性分析结果表明,CmCHS1和CmCHS2在花朵初开和盛开期表达量较高;CmCHS1、CmCHS2、CmCHS3在红色叶片和果皮中的表达量大大高于绿色叶片和果皮,CmCHS4则相对较低。构建原核表达载体p ET-32-CmCHS,体外酶活检测表明,4个CmCHS重组蛋白皆可催化香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素查尔酮。     

中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究

为研究中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中类黄酮代谢途径的调控网络,从其转录组中筛选出1条R2R3-MYB基因并从花瓣cDNA中克隆其编码区全长序列,命名为NtMYB5。NtMYB5开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸。蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域以及1个pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序;系统进化树分析表明,NtMYB5与花青素合成抑制因子亲缘关系最近;通过对NtMYB5在中国水仙中的表达检测发现,其表达量在花器官中较高,且随花开放逐渐上升;在烟草瞬时表达中,NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果;转NtMYB5烟草花瓣颜色变浅,qPCR检测表明NtMYB5抑制类黄酮代谢途径大部分结构基因表达。NtMYB5为中国水仙中花青素合成抑制因子。     

瓜叶菊花青素合成关键结构基因的分离及表达分析

 本文通过RT-PCR的方法分离了花青素合成途径上的关键结构基因片段：CHS、CHI、F3H、F3'H和DFR。在白色系、红色系、紫色系和蓝色系瓜叶菊舌状花中,采用半定量RT-PCR的方法分析CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、F3'5'H、3MaT这7个结构基因在花不同发育阶段的表达模式。结果表明：在白色花中,不存在CHS的表达;在红色花中,检测到F3'H基因的高丰度表达,但没有检测到F3'5'H的转录本;在蓝色花中,没有F3'H表达的信号,但在花序开放的第Ⅰ阶段有较强的F3'5'H的表达信号;而在紫色花中,可以同时检测到F3'H和F3'5'H的转录本。此外,瓜叶菊花青素合成相关结构基因在花序开放初期高丰度表达,随后逐渐降低,在第Ⅳ阶段表达量再次出现升高现象,而在花序开放末期表达量极低或没有表达信号。     

Abscisic acid and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid affect the expression of anthocyanin biosynthetic pathway genes in ‘Kyoho’ grape berries

Summary

The effects of abscisic acid (ABA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) on the expression of seven anthocyanin biosynthetic pathway genes in ‘Kyoho’ grape berries were investigated. In untreated berries, the expression of the UDP-glucose-flavonoid: 3-O-glucosyltransferase (UFGT) gene was detected only at 42 d after full bloom (DAB), whereas the phenylalanine ammonia-lyase (PAL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone-3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR) and leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX) genes were expressed throughout the growing period. ABA increased anthocyanin content in the skin and the expression of PAL, CHS, CHI, DFR and UFGT genes at 7 d after treatment. In contrast, 2,4-D inhibited the accumulation of anthocyanin and the expression of all the genes examined. The results clearly show that the anthocyanin levels resulting from the application of ABA and 2,4-D were correlated with the expression of anthocyanin biosynthetic pathway genes.     

Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition

In grape cultivation, high night temperature generally reduces anthocyanin accumulation in berry skin. To clarify the regulatory mechanism of anthocyanin biosynthesis under the conditions of high night temperatures, we examined flavonoid accumulation, the activities of related enzymes and gene expression in the anthocyanin biosynthetic pathway in grape berries grown under cool and warm night conditions. Anthocyanin accumulation in the skin of berries grown at high night temperatures (30 °C continuous) was reduced as compared to that of berries grown at low night temperatures (30 °C in daytime/15 °C in night time). On the other hand, flavonol levels in the skin of berries were not significantly different between low and high night temperature conditions. High night temperatures also inhibited the gene expression of chalcone synthase (CHS), flavanone 3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX) and UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase (UFGT) at veraison and an increase in UFGT activity after veraison. These results suggest that the inhibition of anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under high night temperature condition could be caused by lower expression levels of anthocyanin biosynthetic genes at an early stage of ripening and lower activities of anthocyanin biosynthetic enzymes, particularly UFGT.     

越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析

以‘泽西’越橘（Vaccinium corymbosum‘Jersey’）不同发育阶段的果实为试材,构建De novo转录组测序文库并进行数据分析,利用WebLogo 3、CLC Sequence Viewer 6等软件和荧光定量PCR技术对所获数据中的R2R3-MYB转录因子进行生物信息学分析和表达分析。结果表明,转录组测序共获得有效数据6.01 Gb,通过组装得到Unigene序列60 481个。功能注释结果显示,有39 612个Unigene可以注释到GO和COG等数据库上;20 869个Unigene无匹配信息。利用GO和COG分类工具可将这些序列分别划分为55个和25个功能类别,涉及信号转导和转录调控等功能。利用所获数据分析越橘R2R3-MYB基因,结果表明共得到21个R2R3-MYB。序列分析显示,这21个基因均含有完整的R2R3-MYB区域,在此区域内2（G）和4（W）等30个氨基酸保守不变。进化树分析结果显示,越橘R2R3-MYB基因分为11个亚组。其中,S4、S5和S6亚组中有6个基因涉及到花青苷生物合成。荧光定量PCR结果分析显示,这6个基因在果实发育的7个阶段均能表达,但表达模式不同,这6个基因可能对越橘果实着色具有一定作用。     

菊花花青素苷合成关键基因表达与花色表型的关系

 以切花菊（Chrysanthemum × morifolium Ramat.）粉色花品种‘日切桃红’（‘DF-3’）和其白色花突变体（‘MD’）的舌状小花为材料,研究花青素苷生物合成途径6个结构基因和3个调节基因表达对花色表型的影响。HPLC分析结果发现,‘DF-3’舌状花中含有2种矢车菊素苷衍生物cyanidin 3-O- （6"-O-monomalonyl-beta-glucopyranoside）和cyanidin 3-O-（3",6"-O-dimalonyl-beta-glucopyranoside）,而‘MD’舌状花中不含花青素苷。半定量RT-PCR分析结果显示,在‘DF-3’中结构基因CHI、F3H、F3′H的表达模式相似,在LⅠ期（花蕾直径 < 0.5 cm）均已有表达,表达量随着花序发育上升,在HⅡ期（外层舌状花直立,未展开）达到高峰,随后逐渐下降;结构基因CHS、DFR和ANS在蕾期表达弱,在HⅡ期表达量达到高峰,随后逐渐下降;且DFR和ANS只在舌状花中表达。调节基因WD40和bHLH均先于结构基因在LⅢ时期（外层1 ~ 2轮舌状花展开）即有强烈表达;MYB在蕾期无表达,在HⅠ期才开始表达,在HⅢ期达到表达高峰。突变体中结构基因和调节基因在各发育阶段的表达量均比野生型下调,其中F3H和ANS表达极弱,DFR始终没有检测到表达信号,调节基因MYB和WD40的表达量下调,bHLH的表达量非常微弱。这些结果表明,菊花舌状花中矢车菊素苷的积累是CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR和ANS等关键结构基因共同表达的结果,突变体中调节基因MYB和bHLH的表达下调可能与其白花形成有密切关系。     

ABA对葡萄花色苷合成相关基因表达的影响

以京优葡萄为试材．研究果实成熟过程中果皮花色苷含量及其生物合成相关酶基因和转录因子转录水平的变化．同时研究不同浓度ABA处理对花色苷含量和相关基因转录水平的影响。结果表明,葡萄果实发育进入着色期,CHSs、CHIs基因家族中的CHS3、CH12和UFGT、MybAJ、MybAl-2随花色苷合成而大量表达,其转录水平与花...     

外源6-BA对‘美乐’葡萄花色苷合成的影响

【目的】探究6-BA对葡萄花色苷合成的影响。【方法】以酿酒葡萄’美乐’为试材,喷施不同浓度的6-BA,以喷施清水为对照,研究6-BA对花色苷含量、组分及其生物合成途径相关基因表达的影响。【结果】100和200 mg·L^-16-BA处理提高了果实着色百分率和内源激素ABA的含量,其中200 mg·L^-1处理促进了花青素的积累,其含量是对照组的4.82倍,相关性分析表明200 mg·L^-1处理组的蔗糖与花色苷含量呈显著正相关。100和200 mg·L^-16-BA处理组的葡萄果实CHS1、F3’H、F3’5’H和UFGT基因的表达量在花后90 d显著提高,6-BA处理组通过影响F3’H和F3’5’H基因的表达量来影响不同花色苷的含量,从而影响果皮色泽。【结论】在果实着色后期,低质量浓度的6-BA通过提高内源激素ABA、可溶性总糖的含量以及相关基因的表达量,促进了花色苷的积累,其中200 mg·L^-16-BA处理效果更佳。