番茄抗病基因Tm-22及其等位基因氨基酸序列的比较

 从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2²等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：'沙龙'、'渝抗2号'和'97-4'分别与'GCR-267'（Tm-2²）、'GCR-236'(tm-2)、以及'GCR-26'(tm-2)有100％的同源性, 而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum. var.cerasiforme）品种'樱红1号'与'GCR-26'（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因 Tm-2²和Tm-2 编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）； 在601-790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2²、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var. dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；（4）樱桃番茄品种'樱红1号'与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。     

菊花和菊花脑DNA甲基化相关酶基因鉴定及表达分析

基于传统菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)品种'金背大红'转录组数据和菊花脑(C.nankingense)的基因组数据,通过生物信息学方法鉴定了二者的DNA甲基化相关酶基因,分析其编码蛋白结构域并构建系统发育树,还分析了基因的表达情况.从'金背大红'中鉴定出了 13个DNA甲基转移酶...     

白菜花茎发育相关基因BcPG17的表达特征分析

在从白菜'矮脚黄'自交系Bcajh97-01中克隆获得多聚半乳糖醛酸酶基因BcPG17及其启动子序列的基础上,采用qRT-PCR、原位杂交和启动子融合表达载体瞬时转化技术,分析了该基因的表达特征.BcPG17的DNA全长为2 105 bp,包含9个外显子和8个内含子.ORF序列长度为1 344 bp,编码447个氨基酸...     

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3'端序列分析

 利用RT-PCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒( SMYEV) 的外壳蛋白基因片段进行特异扩增, 扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RT2PCR检测体系, 并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测, 其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV 的沈阳分离物SY01上扩增出了932 bp的基因组3'末端区域, 其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86% ～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群, 沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内, 但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3'末端形成3个茎环结构, 不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

'寒富'苹果自花结实性分析及S基因型鉴定

 本研究以苹果‘寒富’品种及其亲本为试材,研究其自交亲和性并鉴定其S基因型。田间授粉试验结果显示,‘寒富’品种表现为自花结实,其母本‘东光’品种亦自花结实;而父本‘富士’品种自花授粉结实率极低,初步推断‘寒富’品种的自花结实性可能遗传自其母本‘东光’。利用PCR技术鉴定'寒富'品种S基因型为S1S9。由于‘东光’品种存在同名异物问题,本研究除日本‘东光’品种外,对辽宁省果树研究所、吉林省果树研究所、沈阳农业大学等单位保存的中国'东光'品种的S基因型进行了鉴定,发现除辽宁省果树研究所保存的'东光'品种S基因型为S2S19,与‘寒富’品种无亲缘关系外,其它两个单位保存的'东光'品种中均存在S9基因型,可能为'寒富'杂交育种时的原始母本。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

橘小实蝇对5个品种火龙果果实的产卵选择

[目的]探究橘小实蝇对火龙果不同品种及不同果实成熟度的偏好性.[方法]以'美龙2号'美龙6号'白肉桂热心'普红'和'台湾大红'5个火龙果品种及其全熟、半熟和不熟的果实为材料,探究橘小实蝇在火龙果5个品种及3个成熟度果实上的着卵量;测定火龙果5个品种不同成熟度果实的硬度,分析果实硬度与橘小实蝇着卵量的相关性.[结果...     

秋子梨等九个品种S基因型的鉴定

根据梨S基因高度保守区设计兼并引物,对各秋子梨品种的基因组进行S基因特异性扩增、连接、转化并测序,GenBank中比较后确定各品种的S基因型.9个供试品种的S基因型分别为:秋子梨中的'寒香'为S36Sx,'苹香'为S1S31,'南果梨'为S34S34,'金香水'为S1Si,'延边大香水'为S31S36,'寒红'为S27S34,'小香水'为S29S34,'花盖王'为S31S31S34S34,白梨中的'锦丰'为S19S34.     

番茄溃疡病病原的鉴定和抗性品种的筛选

以番茄"CM966"病株为试验材料,采用PCR的方法和形态学鉴定法对包头市采集的疑似番茄病株进行鉴定,并构建系统发育树,以期确定其分类地位;以17个番茄品系和品种为试验材料,采用与番茄溃疡病相关的QTL位点中贡献率最高的Rcm5.1对17个番茄品系及品种进行特异性PCR扩增,同时进行田间接种试验,探究番茄溃疡病抗性种质资源。结果表明:采自4个不同番茄种植田的疑似溃疡病病株,均携带番茄溃疡病菌。经过BLAST比对,其中4个病原菌的分离物与GenBank中已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,Cmm)的一致性达90%以上,其中1个病原菌分离物序列与其它菌株亲缘关系较远;对17个番茄品系及品种进行检测,均不携带QTL位点中Rcm5.1点的抗性基因,但是田间接种试验表明有3个品系'山东荷兰'圣490'及'紫晶'表现为高抗,病情指数分别为2%、4%、4%。"160""CM966"'T54'及"普罗旺斯"表现为高感,病情指数均大于50%。     

秋子梨品种‘龙香’S基因型的鉴定及梨S_(42)-RNase新基因的序列分析

利用特异引物对秋子梨品种‘龙香'的基因组DNA进行PCR扩增.通过对扩增片段的回收、克隆和测序,获得2条大小分别为469 bp和653 bp的DNA序列,将其推导氨基酸序列与GenBank中已登录的梨S基因的序列进行比对.结果表明:469 bp序列与已登录梨的S16-RNase基因完全一致,确定‘龙香'的1个等位基因为梨S16基因;653 bp序列与梨S基因的相似性在75%～90%之间,且在高变区存在6个以上氨基酸的差异,近一步分析确定为1条新的梨S基因,命名为S42-RNase基因,该基因在GenBank的登录号为:EF088497.确定秋子梨品种‘龙香'的S基因型为S16S42.     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析,结果表明,CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp,编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示,CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示,CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料,qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达,且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明,Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达,并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明,CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

BTH诱导甜瓜愈伤组织活性氧代谢和抗性酶活性的信号途径

通过对含有苯并噻二唑(BTH)、咖啡酸(CA)或氯化钴(CC)等不同MS培养上甜瓜愈伤组织的研究,测定了超氧阴离子(O2■)产生速率、过氧化氢(H2O2)含量及抗性相关酶活性的变化,探讨了BTH诱导的甜瓜ROS代谢和抗性酶活性及其相关的信号途径。结果表明,CA可以消除BTH对甜瓜愈伤组织O2■增加和H2O2积累的诱导作用;CA或CC能够部分抵消BTH对SOD增强的诱导作用;CC对BTH诱导的POD增强具有抑制效应,CA+CC可完全消除BTH对POD的诱导作用;CA和CC均能促进BTH对PAL增强的诱导作用,且具有协同效应。BTH对甜瓜O2■升高、H2O2积累和CAT降低的诱导主要通过SA途径实现,对POD的影响主要通过ET途径实现,对SOD升高的诱导通过SA和ET 2条途径实现,而对PAL活性的影响通过ET和SA以外的途径实现。     

柑橘全爪螨代谢抗性相关基因表达差异分析

【目的】为了明确谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因、羧酸酯酶(CarE)基因,过氧化氢酶(CAT)基因在柑橘全爪螨Panonychus citri抗性中的作用,【方法】在室内用噻螨酮对柑橘全爪螨进行抗性选育,进一步构建抗/敏品系数字基因表达谱,采用RPKM法对柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3种代谢抗性相关基因进行表达差异分析。【结果】经过20代抗性选育,获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系,与敏感品系比较,柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性倍数达到3 532.12倍。基因差异性分析发现,抗性品系中有11条GST基因、17条CarE基因和6条CAT基因表达上调;14条GST基因、24条CarE基因和3条CAT基因表达下调。上调倍数最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分别为Unigene31530[log2 ratio(RS/SS)=1.05]、Unigene23121[log2 ratio(RS/SS)=2.05]和Unigene31477[log2 ratio(RS/SS)=10.04]。进一步对Unigene31477进行荧光定量PCR分析发现,抗性和敏感品系基因表达水平没有显著差异。【结论】根据柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表达差异推断,GST、CarE和CAT基因可能与柑橘全爪螨对噻螨酮产生的抗性没有密切关系。