菜薹BrNAP克隆及其在采后叶片衰老中的功能分析

在菜薹(Brassica rapa var. parachinensis)中克隆Br NAP1并分析其功能。Br NAP1编码区全长813 bp,编码270个氨基酸,具有NAP转录因子特有的保守结构域,属于NAP亚家族成员。Br NAP1表达量与叶片衰老程度呈正相关且受ABA诱导表达上调。亚细胞定位试验表明Br NAP1定位于细胞核。互补试验显示Br NAP1能使拟南芥atnap滞绿表型回复至野生型,过表达则能引起采后叶片早衰。双荧光素酶试验表明Br NAP1能够激活Br SAG113表达。这些说明Br NAP1是菜薹采后叶片衰老的正调控基因。     

苹果MdGLRs家族基因生物信息学鉴定和表达分析

 利用生物信息学策略对苹果MdGLRs家族基因编码蛋白的氨基酸序列的基本特征、二级结构、跨膜区域、亲疏水性、基因亚细胞定位及保守结构域进行了预测和分析,与拟南芥AtGLRs家族的20个基因进行了氨基酸序列比对和进化树分析,并对这些基因在不同营养生长器官中进行了表达分析。结果表明,苹果MdGLRs家族包含32个基因,分为3个亚族,大部分基因编码800个氨基酸以上,多含有3个跨膜区域,二级结构主要以α–螺旋、无规则卷曲、折叠延伸链为主;亚细胞定位预测发现,MdGLRs蛋白主要定位在内质网和质膜上;MdGLRs蛋白的保守结构域是S1-M1-M2-M3-S2-M4;大多数基因在根、茎、叶中普遍都有表达,在叶中的表达量最高。     

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明:UFGT1基因长1 380bp,编码459个氨基酸的蛋白质,该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽;MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异;MaUFGT1在巴西蕉和香粉1号蕉中,随着果实成熟,表达量逐渐上升,后期香粉1号明显高于巴西蕉。说明MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成。     

RNAi沉默CsHB1降低茶树叶片愈伤组织咖啡碱积累

以‘英红9号’茶树叶片为材料,克隆HD-Zip转录因子基因CsHB1,原核表达CsHB1重组蛋白,利用本氏烟草进行CsHB1表达蛋白的亚细胞定位;构建CsHB1的RNAi转基因载体,经农杆菌介导转化‘英红9号’茶树叶片愈伤组织,并对沉默CsHB1愈伤组织系进行基因表达分析和咖啡碱含量测定。结果表明,克隆基因与NCBI登记的‘龙井43’茶树Cs HB1(MF033534)有6个碱基差异,但编码相同的氨基酸序列;原核诱导表达获得CsHB1的49 kD不可溶蛋白;将CsHB1蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞质。在沉默表达CsHB1愈伤组织中,CsHB1表达显著下降,催化茶叶咖啡碱合成的N–甲基转移酶基因yhNMT1表达下调,愈伤组织中咖啡碱含量显著降低。推测转录因子基因CsHB1的沉默抑制了靶基因yhNMT1的表达,进而降低‘英红9号’愈伤组织中咖啡碱的合成积累。     

转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的功能分析

[目的]研究NAC转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的作用.[方法]根据前期果实成熟过程中的蛋白组数据,以八倍体红颜草莓为试材,克隆FaNAC56基因及其启动子.在蛋白水平,利用MEGA构建FaNAC56系统进化树,并通过生物信息学预测其编码蛋白的二级结构,以及利用烟草进行亚细胞定位;在转录调控水平,利用预测网站分析FaNAC56启动子区顺式作用元件以及下游靶基因,并通过RT-qPCR分析FaNAC56的时空表达模式.最后,利用果实圆片温育方法分析FaNAC56基因受外源激素诱导情况.[结果]FaNAC56基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,具有NAC转录因子NAM保守结构域.系统发育分析表明FaNAC56与月季NAC56同源性最高.亚细胞定位显示FaNAC56定位于细胞核内.FaNAC56在果实中高度表达并随果实成熟表达量急剧增加.FFaNAC56启动子区含有ABA、赤霉素、生长素、乙烯等激素和胁迫相关响应元件,其表达水平受这些激素诱导.靶基因分析发现FaNAC56可能响应多种激素、花色苷和蔗糖调控元件.[结论]FaNAC56可能通过多种激素调控草莓果实的发育和成熟.     

荔枝LcBES1的克隆、表达及功能分析

[目的]基于荔枝花穗RNA-seq数据,克隆荔枝BR信号途径的LcBES1,并对其序列特征、表达特点、基因功能及亚细胞定位进行分析.[方法]利用qRT-PCR对LcBES1在不同组织中的表达进行研究,利用MEGA 6软件进行系统进化树分析.通过转基因分析其在拟南芥中的基因功能,利用烟草瞬时转化系统分析其亚细胞定位.[结...     

千层金MbEGS基因的克隆与功能分析

在前期构建的千层金（Melaleucabracteata）转录组数据库中鉴定并克隆得到2个丁香酚合成酶基因MbEGS1和MbEGS2,基因编码区（codingsequences,CDs）序列长度分别为963和972bp,分别编码320和323个氨基酸。序列比对和系统进化树分析表明,MbEGS1、Mb EGS2与仙女扇（Clarkia breweri）CbIGS1蛋白序列相似性最高,达到65.92%和63.89%。qRT-PCR分析表明,二者在千层金的花、叶片和茎中均有表达,其中在花中表达量最高,叶中次之,茎中最低,与不同组织中丁香酚含量的变化类似,基因表达量与丁香酚含量呈显著正相关;MbEGS1在千层金的根中有表达,且表达量高于茎段,但低于叶片,而MbEGS2在根中不表达。采用不同浓度MeJA处理千层金发现,MeJA能够诱导MbEGS1和MbEGS2表达和丁香酚合成,0.1 mmol·L-1 MeJA诱导效果最显著,其转录水平与丁香酚含量呈正相关。亚细胞定位结果表明,Mb EGS1主要定位于细胞质膜和细胞核中,Mb EGS2主要定位于细胞质膜中。在森林草莓中异位表达MbEGS1和MbE...     

黄瓜促分裂原活化蛋白激酶基因的生物信息学分析及原核表达

利用RT-PCR技术结合RACE技术,从NO₃^-胁迫下的黄瓜根中克隆出促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）基因的同源序列,命名为CsNMAPK,GenBank注册号为DQ812086。生物信息学分析表明,该基因全长1 636 bp,开放阅读框（ORF）1 113 bp,编码370个氨基酸。亚细胞定位预测其编码蛋白可能定位于细胞质;跨膜结构分析表明该基因有一个强的跨膜螺旋结构;PlantCare分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、茉莉酸诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、伤害诱导等顺式作用元件。成功构建原核表达载体,并转化E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约46 kD的蛋白。为进一步揭示黄瓜MAPK基因在NO3-胁迫中的作用奠定基础。     

茶树小分子热激蛋白基因CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2的克隆与表达分析

以‘龙井长叶’茶树为材料,通过RT-PCR技术克隆获得了4个小分子热激蛋白基因,其开放阅读框长度分别为600、732、462和657 bp,编码199、243、153和218个氨基酸,根据其编码蛋白分子量分别命名为：CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2。蛋白结构分析显示,CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2蛋白均包含1个由CRⅠ、CRⅡ和β6-loop组成的ACD结构域,属于典型的小分子热激蛋白家族成员。亚细胞定位预测和进化树分析表明,CsHSP22.4主要定位于线粒体中,属于MⅠ亚族;CsHSP17.5主要定位于细胞质内,属于CⅠ亚族;而CsHSP27.4和CsHSP25.2则主要定位于叶绿体中,属于CP亚族。实时荧光定量PCR结果表明,CsHSP22.4和CsHSP27.4在叶中表达量最高,CsHSP17.5和CsHSP25.2在茎中表达量最高,具有一定的组织特异性。另外,CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2均受高温和干旱胁迫的诱导,其中在高温胁迫下表达量呈爆发性增加,表明其均参与了茶树对高温和干旱胁迫响应的过程,且对高温胁迫具有更高的敏感性。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

板栗CmFT基因的克隆及功能分析

【目的】FT(FLOWERING LOCUS T)是成花素基因,探究板栗(Castanea mollissima)CmFT的生物学功能。【方法】在板栗基因组数据库中,检索并克隆板栗FT同源基因,对其基因结构、编码蛋白进行分析。利用荧光定量PCR测定CmFT的时空表达情况。通过亚细胞定位分析CmFT在细胞中的表达位置。通过对CmFT过量表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)的开花性状分析,验证CmFT的生物学功能。【结果】CmFT开放阅读框长度为525 bp,编码174个氨基酸,具有保守的PEBP结构域,定位于细胞核。CmFT在叶片和茎尖均有较高表达,并且于7月在叶片中的表达水平达到峰值。在拟南芥中过表达CmFT可提高开花促进基因AtFT、LEAFY(AtLFY)、SUPPRESSOR OF CONSTANS OVEREXPRESSION 1AtSOC1)及开花抑制基因TERMINAL FLOWER1(AtTFL1)和FLOWERING LOCUS C(AtFLC)的表达水平,并导致植株提前开花。【结论】CmFT为板栗开花素基因,可促进成花。     

毛竹SLAC家族基因鉴定及PheSLAC1功能分析

为了研究S型阴离子通道蛋白（slow type anion channel,SLAC）基因家族在毛竹（Phyllostachys edulis）响应干旱胁迫中的作用,利用生物信息方法以拟南芥和水稻中的SLAC/SLAH家族蛋白序列为模板对毛竹中SLAC家族成员进行鉴定,对其基因结构、进化关系和组织表达等进行分析,并对PheSLAC1的保守功能位点以及在干旱胁迫中的功能进行初步研究。结果表明：毛竹中包含15个SLAC家族基因,其中PheSLAC1.1(PH02Gene01933.t1)和Phe SLAC1.2(PH02Gene00592.t1)在叶片中表达量最高,基因编码区（coding sequence,CDS）序列长度分别为1 716和1 677 bp,分别编码572和559个氨基酸,且包含保守的关键功能位点。亚细胞定位结果表明,PheSLAC1.1和Phe SLAC1.2均定位于细胞质膜中。PheSLAC1.1和Phe SLAC1.2在拟南芥slac1-3突变体中的表达结果表明,其能够部分减轻突变体的干旱敏感表型,表明两者均能够通过调控气孔关闭在毛竹响应干旱胁迫中发挥重要作用。     

桃PpIDD11调控花发育的功能研究

从‘秋蜜红’桃中克隆到1个IDD转录因子基因PpIDD11。结果显示：PpIDD11编码区全长1 575 bp,编码524个氨基酸,具有保守的ID域。烟草亚细胞定位显示PpIDD11蛋白定位于细胞核,酵母转化试验表明其具有酵母转录自激活活性。荧光定量PCR分析显示PpIDD11主要在花器官中表达,特别在雌蕊中转录水平最高。过表达PpIDD11拟南芥株系出现了柱头高于野生型、荚果变短且结实率下降的表型,同时也出现了莲座叶叶片卷曲、植株变矮的现象。转录组测序分析显示,PpIDD11转基因拟南芥株系共有上调基因3 378个,下调基因3 156个,其中包含LOX4、LOX3、GLC、E6L1等花器官发育调控基因。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSULTR3.1的克隆及其对硫和硒的响应分析

从茶树(Camellia sinensis)根系中克隆获得1条长度为1 999 bp的核酸序列,该序列包含1 980 bp的开放阅读框(ORF),编码659个氨基酸。BlastX同源性比对显示,该基因编码的氨基酸序列与葡萄VvSULTR3.1相似度最高(86%),将其命名为CsSULTR3.1(GenBank登录号:KY963793)。进一步分析显示,该基因编码的蛋白分子量为72.39 kD,理论等电点为7.61,属于非分泌性蛋白,包含10个跨膜结构域。以GFP作为标记进行亚细胞定位发现,该蛋白定位于细胞质中。qRT-PCR分析显示,CsSULTR3.1具有组织表达特异性,在茶树茎中表达量最高。CsSULTR3.1在茶树根系中的表达受Na_2SO_4和Na_2SeO_4诱导:60 mg·L~(-1) Na_2SO_4处理12 h后逐渐上调表达,在48 h时达到最大值,而240 mg·L-1Na_2SO_4处理12 h内显著下调表达,随后显著上调并维持相对稳定状态;在不同浓度Na_2SeO_4处理条件下表达量均呈现先降低后升高再降低的趋势,且均在48 h时达到最高。     

卷丹LlAGO1基因的克隆及表达分析

以卷丹（Lilium lancifolium）叶腋组织为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到AGO1基因的cDNA全长,命名为LlAGO1。其全长4 014 bp,开放阅读框长3 687 bp,编码1 228个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为135.36 kD,理论等电点（pI）为9.57。氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和Piwi两个AGO1典型的结构域;信号肽预测结果表明LlAGO1蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白;亚细胞定位预测其主要定位于细胞核;与相关同源蛋白高度相似,且与芦笋AGO1a蛋白（XP_020260210.1）亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明：LlAGO1在卷丹叶腋、鳞片、根、叶等不同组织均有表达,其中在叶腋中的表达量最高,叶片和根中的表达较弱;腋生珠芽形成过程中,LlAGO1仅在可形成珠芽的上部叶腋表达,且在珠芽形成时表达量最高,而在不形成珠芽的下部叶腋几乎不表达,推测LlAGO1可能与卷丹珠芽的形成相关。     

荔枝GA信号途径基因LcPIF4的克隆及其功能分析

【目的】克隆荔枝GA信号途径的LcPIF4基因,并对其序列特征、表达特点、基因功能、亚细胞定位及互作蛋白进行研究。【方法】利用花穗RNA-seq数据对LcPIF4基因进行生物信息预测及分析,通过qRT-PCR对LcPIF4基因在不同组织的表达进行研究,并在表达水平上分析其对烯效唑的响应。通过拟南芥转基因株系的构建对其基因功能及亚细胞定位进行分析,同时利用酵母双杂分析其与Lc DELLA-1蛋白的互作。【结果】克隆的荔枝LcPIF4基因ORF长1 617 bp,编码539个氨基酸,且具有经典的APB结构域和HLH结构域。qRT-PCR结果表明,LcPIF4基因在花穗、叶片、果皮等器官表达水平较高,且烯效唑处理后其表达水平显著下降。转基因试验表明,在拟南芥中过表达LcPIF4基因可促进下胚轴生长,且过表达LcPIF4-YFP的转基因材料可在细胞核位置检测到荧光信号。酵母双杂交结果表明,LcPIF4与赤霉素途径阻遏蛋白LcDELLA-1存在直接的蛋白互作。【结论】荔枝LcPIF4蛋白具有拟南芥PIF4蛋白相同的结构域;LcPIF4在花穗中高表达,且其表达被烯效唑所抑制。LcPIF4可促进拟南芥下胚轴生长,其编码蛋白定位于细胞核。LcPIF4蛋白与Lc DELLA-1在酵母中存在互作。     

金线莲ArLBD1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)叶片的转录组数据为基础,采用RT-PCR技术克隆到了金线莲ArLBD1转录因子基因,采用生物信息学、原核表达、Western blot、亚细胞定位及qPCR等方法对该基因功能进行初步分析,以期为进一步研究其功能提供参考依据。结果表明：ArLBD1基因CDS长度864 bp,编码287个氨基酸。ArLBD1蛋白分子量为30.62 kD,理论等电点为6.25,不稳定系数55.55,属于不稳定蛋白。ArLBD1蛋白含有LOB superfamily保守结构域,第7～28氨基酸为C基序,第36～84氨基酸为GAS基序,第89～107氨基酸为类亮氨酸拉链基序,具有完整的类亮氨酸拉链基序,属于ClassⅠ。系统进化分析表明ArLBD1与拟南芥AtLBD36的亲缘关系最近,其次是AtLBD6。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,ArLBD1基因在大肠杆菌中成功诱导表达。亚细胞定位分析发现ArLBD1蛋白定位在细胞核。qPCR分析结果表明,ArLBD1基因在金线莲叶、茎和根中都能检测到表达,在叶片表达量最高,其次是根,茎的...     

‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核表达

 以‘秦冠’苹果为试材,采用RT-PCR方法获得了一个WRKY基因,全长1 224 bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其可能参与植物与病原菌的互作。随后进行原核表达分析,SDS/PAGE电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。     

淀粉酶家族基因在金针菇子实体不同发育时期的表达与分析

为分析淀粉酶对金针菇(Flammulina velutipes)子实体发育的作用,针对已经鉴定的金针菇淀粉酶家族基因(6个α-淀粉酶和1个γ-淀粉酶),采用定量PCR方法对其在不同发育时期(从原基形成第1天到第12天成熟开伞期)、不同组织部位(菌盖和菌柄)的表达量进行测定,进而分析其表达模式。结果显示:7个淀粉酶基因在菌柄中表达量均高于菌盖;其中,α-Amy-5和γ-Amy-1在菌柄中的表达量变化为先下调再上调,两个基因预测编码蛋白均有信号肽,亚细胞定位在细胞外,推测其可能参与菌柄细胞壁的形态建成;α-Amy-3亚细胞定位在线粒体中,与其它各发育时期相比,其在菌柄快速伸长期表达量达到最高。α-Amy-1和α-Amy-6基因则在金针菇成熟期表达量最高,推测其可能与金针菇菌盖的发育有关。     

香蕉MaTIFY1转录因子特性及其在成熟过程中基因表达分析

从香蕉果实中分离获得1个TIFY亚族的转录因子基因,命名为MaTIFY1。该基因含有一个681 bp的ORF,编码一条长度为227 aa,分子量为24.97 kD,等电点为7.85的氨基酸多肽链。MaTIFY1定位于细胞核,并且具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MaTIFY1随着香蕉果实成熟进程表达明显增强,并且外源丙烯处理可诱导其表达。此外,MaTIFY1启动子活性受乙烯利诱导激活,进一步表明MaTIFY1可能参与香蕉果实成熟的调控。原核表达并纯化了MaTIFY1重组蛋白。