柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。     

猕猴桃溃疡病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为建立猕猴桃溃疡病PSA病原菌的实时荧光定量PCR方法,根据hrpW基因设计一对引物P3F/P5R,扩增片段大小为247bp,构建该片段的阳性质粒用于荧光定量PCR标准曲线的制作;评价引物的灵敏度、特异性,并验证其实际应用效果。结果表明,该方法能特异性地检测出PSA病原菌,灵敏度为100fg/μL。以采集的无病症和有病症猕猴桃枝条为样品,本方法可检测到无病症枝条中最低浓度为8.45×10-5 ng/μL的PSA病原菌。本实验建立的实时荧光定量PCR检测猕猴桃溃疡病菌方法可用于猕猴桃溃疡病感病样品的早期诊断,对该病原菌的预防诊治具有重要意义。     

杜鹃花枯萎病菌TaqMan MGB探针实时荧光快速检测方法

根据杜鹃花枯萎病菌(Ovulinia azaleae)及其近似种ITS基因序列差异,设计合成1对特异性引物和1条Taq Man-MGB探针,建立了杜鹃花枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测杜鹃花枯萎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量0.25 pg;实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带杜鹃花枯萎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后处理,为杜鹃花枯萎病菌早期诊断检测提供了重要参考。     

葡萄炭疽病可视化LAMP检测体系的建立及应用

【目的】建立葡萄炭疽病LAMP检测方法。【方法】在葡萄炭疽病菌ITS序列片段设计LAMP特异性引物,优化反应条件,建立葡萄炭疽病LAMP检测体系,并利用荧光显色剂(0.05 mmol·L-1钙黄绿素和0.5 mmol·L-1氯化锰混合液)实现检测结果的可视化;同时对该体系进行特异性和灵敏度的验证,对采集自5个地区的田间样品进行实测。【结果】除染病的待检样品有特异性反应,观察到亮绿色荧光信号外,其他供试菌株均无特异性扩增反应;对葡萄发病组织总DNA的检测灵敏分别是定量PCR和常规PCR的1/10和100倍,检测限达到了5×10-4mg·L-1;对来自福建等5个地区的样品进行实测,结果表明待检样品中有81.5%感染葡萄炭疽病菌,该检测结果与定量PCR的检测结果完全一致。【结论】本研究建立了一种基于荧光显色的可视化LAMP检测体系,该体系可用于葡萄炭疽病的田间样品检测。     

柑橘溃疡病菌分化及防治研究进展

对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)的分类地位、菌系分化和致病机理进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学方法鉴定溃疡病菌遗传变异的研究进展,并介绍了该病的防治方法。     

柑橘黄龙病菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

建立基于双重荧光定量PCR检测柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的方法,并对其准确性进行验证。通过受试者工作特征(ROC)曲线、净重分类改善指数(NRI)和综合判别改善指数(IDI)分析7对CLas实时荧光PCR引物及其联合检测的准确性,评价RNRf/RNRr联合CLas-4G/HLBr的双重实时荧光PCR对CLas的检测价值。ROC曲线分析结果显示,表现最好的引物是RNRf/RNRr,其曲线下面积(AUC)为0.971,高于其他6对引物;其次是CLas-4G/HLBr引物,AUC为0.966;在双引物联合检测中,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测、CQULA04F/CQULA04R+RNRf/RNRr引物并联检测的相关性能指标较优,AUC分别为0.963和0.966,并且RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测同时具备较高的敏感性(85.19%)和特异性(99.25%)。NRI分析结果表明RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr串联检测的诊断能力相较于LJ900f/LJ900r的单一引...     

苹果坏死花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

根据GenBank数据库已登录序列设计了12对苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)的检测引物,通过引物筛选和体系优化,建立了以ApN1-F3/R3为引物的ApNMV的TB Green染料法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.3%,相关系数为0.997,灵敏度是常规PCR的100倍。采用q PCR方法对60份田间苹果样品进行检测,结果显示,常规PCR对ApNMV的检出率为51.7%,而qPCR的检出率为56.7%。该技术适用于田间样品的检测。     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的樱桃病毒A(CVA)的检测方法

根据樱桃病毒A(cherry virus A,CVA)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了樱桃中CVA的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。该方法可在恒温38℃条件下进行,40 min即可完成检测。灵敏度试验表明,采用RPA方法检测CVA的灵敏性是PCR方法的10倍,且与侵染樱桃的另外6种病毒和1种类病毒无交叉反应。此外,具有标记的扩增子可通过侧向流试纸条直接观察结果。采用该方法检测田间样品效果良好。     

李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立

根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因,对柑橘促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因家族进行注释和功能域分析,明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’(Fortunella japonica Swingle)和感病品种‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中受病原菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)诱导的表达情况;并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员,根据系统发育树将其分为3个亚类,均含有促分裂原活化蛋白激酶(Pkinase)功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高,CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗(感)品种中均受病原菌强烈诱导,且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种;CsMPK3和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应;CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调,而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照;...     

柑橘种质抗柑橘蒂腐病菌扩展能力的评价

采用柑橘离体叶片和果实室内人工接种柑橘蒂腐病菌的方法建立柑橘种质抗柑橘蒂腐病菌扩展能力的评价方法,对不同柑橘种质进行抗扩展能力评价,并采用病情指数法、病斑平均直径法和聚类分析方法对柑橘种质进行抗性分级。3种分析方法均将73个柑橘种质划分为5类：高抗、抗病、中抗、感病和高感,未发现免疫种质。柠檬和柚子类种质大多数为高抗品种,甜橙类和宽皮橘类易感病。     

枸橼种质对柑橘溃疡病的抗性鉴定

柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)是严重阻碍柑橘产业发展的世界性检疫病害,防控困难,选育抗病品种为防治溃疡病的唯一有效办法。枸橼C-05是柑橘属独特的抗溃疡病种质,为抗性机理和抗病育种提供了种质基础。为了进一步评价枸橼C-05的抗性,另外收集了13份枸橼种质,对其进行溃疡病的离体和活体抗性评价。叶片形态学观察表明,14份枸橼种质存在较大的形态学差异。采用离体与活体注射接种不同浓度的柑橘溃疡病菌,根据叶片的感病症状、病斑周围黄色晕圈大小等典型溃疡病症状,综合评价枸橼类种质的抗病性。结果表明:枸橼种质之间对溃疡病的抗性存在极大差异,溃疡病的抗性评价综合病情指数显示枸橼C-05、园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼和印度大果综合病情指数较小,表现为极抗病或抗病,其他枸橼种质表现不同程度的感病性;枸橼种质的抗病或感病性与其叶片形态特征无关。枸橼C-05和5个抗病枸橼种质对柑橘溃疡病具有针对性的抗性,这对进一步研究抗病机理和抗病育种具有重要意义。     

应用PCR技术快速检测柑桔溃疡病的研究

应用PCR检测柑桔溃疡病，所用引物为5′TTGGTG TCGTCGCTTGTAT 3′和5′CACGGGTGCAAAAAATCT 3′。从病样的叶片、果皮和枝皮抽提溃疡病菌核酸进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，产生大约220bp的特征条带，与纯培养溃疡病菌的PCR产物一致。试验比较两种核酸抽提方法，微量快速抽提法的灵敏度明显高于高盐抽提法。有症状病样品的不同部位均能检测到溃疡病；病株的无症状叶片、果皮、枝皮有部分检测到病菌。病果园健康植株大多数检测不到病菌，少数植株PCR产物电泳条带较弱。取样量以10～20mg为宜。该PCR技术可用于快速检测柑桔溃疡病。