福建省猪瘟病毒流行毒株EO基因的克隆与序列分析

【目的】对我国福建省流行的猪瘟病毒E0基因进行序列测定及分析。【方法】应用RT-PCR,从我国福建省送检的54份病料中扩增出14份猪瘟病毒E0基因,将其克隆到T载体上并测序。利用DNAstar分析软件,对所测定的14株流行毒株与参考毒株的相应基因片段进行同源性及序列分析。【结果】得到约801bp的猪瘟病毒E0基因片段。序列分析表明,14株福建流行毒株可分为2个基因群,其中FJ216与ALD、Alfortl87、Brescia、CHVRI、GPE、Glentorf、CAP、Shimen和HCI。V等我国主要参考毒株属于基因1群,其他13株流行毒株和我国另一分离株GXWZ02属于基因2群。基因1群的FJ216与HCLV的核苷酸和氨基酸同源性分别为95．0％和94．3％,与Shimen的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．4％和99．1％;而另外13株流行毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89．7％～99．9％和93．84％～99．6％,13株流行毒株与HCLV株的核苷酸和氨基酸同源性分别为81．8％～88．1％和86．8％～89．5％,与Shimen株的核苷酸和氨基酸同源性分别为83．4％～90．8％和88．6％～93．9％。得到的14株猪瘟病毒E0基因具有RNase活性的2个区域均高度保守,没有发生变异。【结论】福建省近期流行的猪瘟病毒以基因2群为优势毒株,而且大多数与HCLV、Shimen毒株之间存在较大差异。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT—PCR法,以1株H5N1。亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA。将NP cDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行测序。测序结果表明：所克隆的NP基因全长1542bp,该核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92．5％～95．9％,编码的氨基酸同源性为97．0％～98．4％。通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

鸡传染性支气管炎TJ9602毒株S1基因的序列分析

将RT－PCR法扩增的IBV TJ9602毒株S1基因，连接到pDM18-T载体上，克隆后进行核酸序列分析，证实TJ9602毒株S1基因与Genebank中发表的国外毒株H120和M41的同源性较低，分别为81．1％和80％，与国内JX9901毒株的同源性达到91．3％，初步证实国内存在IBV新毒株。     

国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析

用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。     

2个猪瘟野毒株E2基因主要抗原区域的扩增及其序列分析

用RT-PCR技术对华东地区2份猪瘟病料的E2基因主要抗原编码区域进行了扩增和序列分析。结果表明这2个毒株的棱苷酸序列同源性为97．321％、氨基酸序列同湃性为100％，但2个毒株的序列与我国的标准强毒Shimen株、疫苗毒HCLV株的差异较大，核苷酸序列、氨基酸序列均只有80％左右，与法国Alfort、意大利C1W株棱苷酸和氨基酸序列的同源性分别为84％～87％和91％。参考国内外对猪瘟病毒基因组的分型方法，将这2株猪瘟病毒归为基因Ⅱ型。     

幼鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株 VP2基因的克隆和分析

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），扩增并克隆传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）SH9901 VP2基因，并对其进行全序列测定。结果表明，克隆到的VP2基因序列长1.3kb；强毒株SH9901 VP2片段与超强毒株OKMY高度相似；核苷酸与氨基酸同源性分别为99.26％，99.8％。     

内蒙古绒山羊MTNR1α盛因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNR1α基因外显予2扩增引物序列。以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析。结果表明,绒山羊MTNR1α外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99．2％,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98．5％、96．8％、82．O％和78．4％,内蒙古绒山羊MNTR1α基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97．7％,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94．1％、91．8％、82．2％、83．1％。     

传染性囊病病毒CJ801VP2基因cDNA的序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ从传染性囊病病毒ＣＪ８０１的第１４代囊毒中扩增编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ基因片断，长度为１５００ｂｐ，，并对该片断进行了ＤＮＡ序列分析。结果表明，ＣＪ８０１与ＩＢＤＶ标准Ⅰ型毒株５２／７０，ＳＴＣ和Ｃｕｌ的同源性最高，分别为９７．４％，９７．６％和９６．９％，与变异株，Ａ，Ｅ，ＧＬＳ的同源性稍低，分别为９６．５％，９６．３和９６．７％。     

犬冠状病毒V1株核蛋白基因的克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒V1野毒株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N基因序列,设计了1对特异性引物,对分离的CCV V1野毒株进行了RT—PCR扩增;将扩增得到的阳性PCR片段经纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN1,进行核苷酸序列测定,并与GenBank中CCV标准毒株Insavrc—1 N基因进行了比较。结果该基因全长为1146bp,编码382个氨基酸,两者核苷酸的同源性为91．7％;推导的氨基酸序列的同源性为90．2％,显示出较高的保守性。在V1野毒株推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒相应区域相同,推测可能是RNA结合区。另外,推导的该蛋白氨基酸序列其疏水性和抗原表位与标准毒株Insavc-1 N蛋白存在一定的差异;在氨基酸组成上,该蛋白丝氨酸和赖氨酸含量高达9．84％,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构：     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析

采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。     

免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

[目的]鉴定免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒（IBV）。[方法]以接种IBV的鸡胚尿囊液为模板,根据GenBank中登录的IBV的N基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出目的片段,经酶切鉴定后对其进行测序鉴定。[结果]PCR扩增片段长度为409bp,将其Ⅳ基因核苷酸序列与不同地区分离株（山东、黑龙江等）以及欧洲呼吸型疫苗株（M41）的IBV核苷酸序列进行比较,结果表明,不同毒株的核苷酸同源性在85．6％～100．0％,此次分离所得IBV的N基因与IBVSD0708株（EU352625）N基因的核苷酸同源性高达99．3％,而与呼吸型疫苗株M41（M28566）的同源性仅为87．3％。测序结果及序列分析可以证实分离到的病毒为IBV,命名为HN／HL株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎病毒的控制奠定了基础。     

贵州辣椒脉斑驳病毒的检测及株系分化研究

[目的]明确贵州辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)的分布和遗传进化情况,为该病毒的基因功能及其与宿主植物互作关系研究提供科学依据.[方法]采用反转录PCR(RT-PCR)对采自贵州贵阳、遵义、黔西和大方的疑似ChiVMV辣椒样品进行扩增并测序;运用DNAMAN和MEGA对ChiVMV CP基因和和3'-UTR进行序列拼接及分析,并构建系统发育进化树.[结果]从39份疑似ChiVMV辣椒样品中检测出7份阳性样品,检出率为17.95%.将贵州ChiVMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列在NCBI中进行核苷酸序列比对,发现其与来源于四川辣椒上的ChiVMV株系的同源性最高,为99%,与我国其他省份ChiVMV株系同源性大于90%;构建的系统发育进化树表明贵州株系与四川和云南株系亲缘关系最近.[结论]贵州ChiVMV株系存在明显的株系分化现象.     

鸡传染性喉气管炎病毒长葛株gE全基因的克隆与序列分析

[目的]防治鸡传染性喉气管炎,减少该病对养鸡业造成的损失。[方法]参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因序列设计并合成1对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1 550 bp的特异性条带,并克隆至pGEM-T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gE基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定。[结果]与GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因和其他部分疱疹病毒gE基因序列进行比较,发现传染性喉气管炎病毒间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.9%、99.8%;与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性分别为25.6%、23.9%、28.3%、26.1%。[结论]不同ILTV毒株之间gE基因差异甚小,gE基因比较保守,但与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性较低。该研究为gE基因的功能研究提供了依据。     

单核细胞增生性李斯特菌mpl基因的克隆及其原核表达载体的构建

研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建.通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体.经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为1...     

猪瘟病毒石门株动物传代脾毒与组织培养细胞毒E2基因序列的分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。     

猪瘟病毒新疆南疆野毒株E2基因高变区扩增及序列分析

参考已发表在GenBank中CSFV Alfort毒株的E2蛋白基因序列，选择其抗原编码高变区作为扩增的靶区域，设计了一对特异性引物。用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取猪瘟病料细胞总RNA，对其进行了RT—PCR扩增。结果得到了与设计大小272bp完全相符的核酸带，并对PCR产物直接进行了核苷酸序列测定。将所测序列与中国C株同段序列进行了比较和分析。结果发现与中国C株核苷酸的同源性均为82．8％；推导的氨基酸同源性为88．3％；两野毒株均有33个碱基发生改变。并用此病料对加日龄易感仔猪成功进行了人工感染试验，结果发现能引起比较典型的猪瘟临床症状和病理变化，表明新疆南疆存在着中等或倔强毒力的野毒株。     

口蹄疫病毒Akesu/58持续感染分离株P1基因的克隆及序列分析

以持续感染模型动物牦牛的食道/咽部分离物(O/P液)为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了P1结构蛋白基因的全序列。序列测定和分析结果表明,持续感染分离株的序列与Akesu/58参考毒株的序列相比,其同源性为86.5 %,而与china/99的同源性高达89.4 %。氨基酸差异分析表明,氨基酸相应的密码子中T-C或A-G互变频率较高,这可能是导致氨基酸改变的主要因素。     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.