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根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753 bp的片段.将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定.测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Roset... 相似文献
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经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
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【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加(AA)鸡的脂蛋白脂酶基因(LPL)进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡LPL基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列(CDs),大小均为1473 bp,两者的同源性为99.4%;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基503T→C导致氨基酸168Val→Ala,606T→G导致202Asp→Glu,1066A→G导致356Thr→Ala,1277C→T导致426Ser→Phe,1420A→G导致474Arp→Gly,1432G→A导致202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。 相似文献
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【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加(AA)鸡的脂蛋白脂酶基因(LPL)进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡“也基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列(CDs),大小均为1473bp,两者的同源性为99.4%;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基^503T→C导致氨基酸^168Val→Ala,^606T→G导致^202Asp→Glu,^1066A→G导致^366Thr→Ala,^1277C→T导致^426Ser→Phe,^1420A→G导致^474Arp→Gly,^1432G→A导致^202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛种布鲁氏菌SP41基因序列,设计合成了一对特异性引物。从牛A19疫苗中提取全基因组DNA作为模板,PCR扩增出SP41基因,连入pEASY-T3载体,测序结果表明,扩增的片段含有1 302个核苷酸,编码433个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的布鲁氏菌2308、A-13334、S19、9-941序列的氨基酸同源性为100%;与布鲁氏菌ATCC、CCM4915、M28、M5-90、NI的氨基酸同源性为99.8%。布鲁氏菌SP41基因的克隆,为获得重组SP41蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。 相似文献
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幽门螺杆菌cagT蛋白的表达、纯化及免疫原性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了解析cagT蛋白的结构,进而了解cagT基因在幽门螺杆菌致病中的作用,应用PCR技术从幽门螺杆菌26695菌株基因组中扩增cagT基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)栽体,转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫家兔制备抗体并鉴定其抗原性.成功克隆cagT基因,重组cagT基因片段的测序结果与GenBank上公布的序列相同.重组cagT蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,免疫家兔所得的抗体滴度为1:32.结果构建了高效表达cagT蛋白的重组载体pET-28a(+)-cagT,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为后续的结构和功能研究奠定了基础. 相似文献
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哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表达与免疫原性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231.构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符.重组蛋白以包涵体形式表达.以脲素法得到初步纯化的重组蛋白,以50 μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4~8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率.结果表明,4~8周内特异性抗体效价持续升高,达到log2 8.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%.试验结果显示了重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗的开发对象. 相似文献
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采用热酚水法提取布鲁氏杆菌脂多糖,分离、纯化并SDS-PAGE银染鉴定。纯化的细菌内毒素免疫小鼠,通过斑点ELISA测定血清抗体效价,检测细菌内毒素免疫原性。采用热酚法能获得较高纯度的细菌内毒素,其免疫原性较高,斑点ELISA测血清效价达到1∶1 000 000,与全菌免疫原性接近。本研究为制备布鲁氏杆菌单克隆抗体和建立布鲁氏杆菌病快速诊断方法奠定研究基础。 相似文献
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克隆牛布鲁氏菌的甲酰基转移酶基因(Wbkc),在大肠杆菌中表达/纯化,并对甲酰基转移酶的抗原性进行分析。以牛布鲁氏菌的染色体DNA为模板,扩增Wbkc基因,双酶切后克隆至pET-28a上,在大肠杆菌BL21中诱导表达,His Trap FF层析柱纯化,Western blot鉴定甲酰基转移酶的抗原性。提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。SDS-PAGE分析证明,表达产物为相对分子质量29 000的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有特异的免疫反应原性。 相似文献
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设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。 相似文献
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【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域(249 bp)、C域(198 bp)、D域(69 bp)和E域(489 bp)组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高(57.82%),与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris(46.05%)、Scaptotrigona depilis(45.94%);系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。 相似文献