白刺花硬实种子的休眠机制及休眠解除

[目的]探索白刺花硬实种子的休眠机制及解除休眠方法,为改进植物硬实种子播种育苗技术提供参考依据.[方法]开展白刺花种子种皮的吸水性、种胚活力及种胚萌发特性试验,分析其种皮和种胚对休眠的影响;测定其种子内源抑制物活性,利用酸腐、碱腐、激素、沸水和机械处理等方法进行破眠,筛选适宜解除白刺花种子休眠的最佳方法.[结果]白刺花种子剥除种皮后2 d即可充分吸胀,而完整种子吸水5 d后才达到饱和;白刺花种胚活力为73.5%,具有相对高的发芽潜力;剥离种皮的种胚发芽率最高,为72.99%,显著高于完整种子和仅具胚的种子(P<005);白刺花胚乳和胚中均含有抑制种子萌发的物质,其中50.0%胚乳浸提液可使小白菜种子萌发率降至75.85%;划破种皮破眠法可使白刺花种子发芽率达72.42%,其次是98%浓硫酸+300.0 mg/L GA3浸泡12 h处理(发芽率为57.42%).[结论]白刺花种皮的透水和透气性、胚乳及胚中所含的抑制物是影响白刺花种子休眠的主要因素.机械划破种皮、用98%浓硫酸(酸腐)+300.0 mg/L GA3浸泡12 h处理(激素浸泡)软化种皮能有效解除白刺花种子休眠,提高其萌发率,可在植物硬实种子播种育苗中推广应用.     

紫斑牡丹种子内源抑制物活性研究

采用生活物活性测定方法,研究了不同方法处理的紫斑牡丹(Paeonia rockii)种皮、胚乳水提液对白菜种子萌发、幼苗生长的影响,探讨了紫斑种子内源抑制物活性。结果发现:紫斑牡丹种皮、胚乳中含有抑制白菜种子萌发及幼苗生长的物质,该物质抑制作用随着浓度的增加而增强;相同浓度和处理下,胚乳浸提液的抑制效果显著高于种皮;各层积处理均在一定程度上降低了紫斑牡丹种子抑制物活性,5~15℃变温和200mg/L的GA3浸泡24h处理的紫斑牡丹种子抑制物活性变化值最大。因此,紫斑牡丹种皮和胚乳中存在内源抑制物,能够抑制种子萌发,可能是紫斑牡丹种子休眠的主要因素。     

凤丹种子休眠特性研究

以凤丹种子(Paeonia ostii)为试验材料,通过对凤丹种子种皮透水性、种胚形态和生活力、种子内源抑制物质活性的测定,研究凤丹种子休眠特性。结果表明:凤丹种皮降低种子吸水速度,但不影响最终吸水率,完整种子浸种56h种子吸水基本达到饱和,对凤丹种皮进行酸蚀或去皮处理不会提高萌发率,凤丹种皮不是休眠的主要原因;成熟的凤丹种子生活力达95.6%,但种胚发育不完全,其需经过一定时间的层积,种胚才能不断生长分化,完成后熟;种皮和胚乳中含有的萌发抑制物质对白菜种子和自身种子萌发有显著抑制作用,且种皮和胚乳中的抑制物含量和种类不同;300mg·L-1的外源GA3能够有效提高凤丹种子萌发率。凤丹种子休眠是由于种胚发育不完全和生理后熟以及种子内存在抑制物质引起的综合休眠。     

白藓种子休眠原因及解除方法研究

为了明确白藓种子休眠的原因,本试验从种子形态、透水性、内源抑制物等方面进行研究,结果表明,白藓种胚各部位已发育完全,平均胚率为95.3%,不存在形态后熟;完整种子吸水10h后吸水率达到44.09%,满足萌发的生理需求,种皮基本上不存在吸水障碍;种皮内源抑制物质活性高于种胚,强烈抑制白菜种子萌发、幼苗茎长和根长;离体胚可以萌发,但胚根伸长受到抑制,说明种皮内存在抑制白藓种子萌发的物质,种胚内存在抑制胚根生长的物质。外源GA3浸种对打破种子休眠有一定作用,低温层积可以有效解除种子的休眠。     

麻花秦艽种子吸水和萌发特性的研究

研究了不同温度(4、20℃)下麻花秦艽种子吸水规律和不同浓度赤霉素、硫酸、双氧水和高锰酸钾处理的种子在光照、黑暗条件下的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的变化.结果显示:供试种子在4℃和20℃时吸水规律均符合Logistic曲线方程,分为急剧吸水期、稳定吸水期和饱和吸水期3个阶段.在20℃的最大吸水速率是4℃的1.99倍,为23.90g/h.高浓度的硫酸(4、8mol/L)和双氧水(3%、5%)可抑制供试种子的萌发,而其他浓度处理均可打破供试种子的休眠.种子发芽质量最佳条件为1.5%高锰酸钾处理10min,光照培养.在此条件下,麻花秦艽种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别比对照提高了106.90%、521.43%、266.71%、709.66%(P<0.01).不同处理下供试种子萌发对光的响应存在差异性.     

乌苏里鼠李种子休眠机理及萌发特性研究

【目的】确定乌苏里鼠李种子休眠类型,探索有效解除种子休眠的方法,为其种质资源利用、种子扩繁等提供理论指导。【方法】以2018年9月采集的乌苏里鼠李种子为材料,研究种子的生物学特性、吸水特性、休眠特性以及种子内源抑制物活性,确定种子的休眠类型;用体积分数98% H₂SO₄、质量分数5.5% NaClO、热水和不同浓度（1,2,3 mol/L）NaOH对乌苏里鼠李种子进行处理,探索解除种子休眠的有效方法。【结果】乌苏里鼠李种子成熟后,种皮为黄褐色至黑褐色,种皮有蜡质,种子长形卵圆状,表皮光亮、质地坚实、结构致密、种胚紧密;千粒质量为（19.6±1.0） g;纵径为（5.0±0.2） mm,横径为（3.8±0.2） mm。在室温条件下,乌苏里鼠李种子的吸水率随浸种时间的增加呈抛物线型变化,表明其种皮透水性良好,对种子的吸水阻碍较小。乌苏里鼠李种子的生活力平均值为96%,但发芽率和发芽势均为0%,种子本身具有休眠特性。随着乌苏里鼠李种子浸提液质量浓度的增加,内源抑制物对白菜种子发芽率和根长的抑制作用均明显增加,对白菜种子根长的抑制活性呈上升趋势。采用体积分数98% H₂SO₄和质量分数5.5% NaClO处理乌苏里鼠李种子,均不能解除其种子休眠;分别采用40～60 ℃热水浸种20 min或者1～3 mol/L NaOH浸种20～120 min,均具有破解其种子休眠的作用。【结论】种皮障碍和内源抑制物是限制乌苏里鼠李种子发芽的主要原因,乌苏里鼠李种子属于综合休眠型;40 ℃热水处理20 min或1 mol/L NaOH处理40 min可有效解除种子休眠。     

栝楼种子休眠特性分析

 【目的】通过从种皮及内源抑制物两个方面探索栝楼（Trichosathes kirilowii Maxim）种子休眠原因,找出其萌发难的症结所在,并有针对性地提出提高种子萌发率的可行措施。【方法】对照完整种皮,设置了刀割种皮和去除种皮的处理,以探究种皮对栝楼种子萌发率的影响;同时分种皮和种仁两部分分别用水、甲醇、乙醚提取其中萌发抑制物,并以白菜种子作为生物鉴定材料,测定其在各种提取物作为萌发基质下的萌发率、淀粉酶活性、苗高、根长及鲜重,以求确定抑制物的分布、极性并初步推测抑制物类型。另外,用GA3处理栝楼种子,并设置不同浓度和不同处理时间对比试验,以求探索栝楼促萌措施。【结果】去种皮处理组与对照吸水率基本持平,但却能显著增加栝楼种子的萌发率。种皮甲醇浸提液对白菜种子的萌发及淀粉酶活性抑制程度最强,而种仁的各种浸提液中,乙醚浸提液的抑制作用较强。200 mg?L-1 GA3对栝楼种子萌发率促进最大,对种子进行适宜浓度GA3的4 d浸泡,对萌发率促进较大。【结论】种皮所引起休眠的物理原因源于其机械阻碍,与其透水性和透气性无关。栝楼种皮中含有相当浓度的萌发抑制物,且主要成分为极性物质;种仁中包含非极性萌发抑制物。可通过机械破皮、流水冲滤、赤霉素处理等方法提高栝楼种子萌发率。     

射干种子萌发抑制物特性研究

探讨射干种子休眠原因,研究其内源抑制物质的存在部位及其特性,可以为射干种子休眠机理与破休眠技术的深入研究奠定基础,为射干种苗高效繁育提供参考.观察记录射干种子的形态结构后,将其置于蒸馏水中浸泡,定时取出称重,测定射干种子的吸水规律;在花盆中分别播种去皮和带皮的射干种子,观察其萌发情况;采用培养皿滤纸法,以蒸馏水处理为对照(CK),研究不同浓度的射干种皮浸提液和胚乳浸提液对小麦种子萌发及幼苗生长的影响.结果表明:射干种子外覆致密的黑色种皮,种子吸水速率呈先快后慢的变化,种皮透水性良好,不存在吸水障碍;射干去皮种子的发芽率和发芽势均显著高于带皮种子,种皮中可能存在影响种子萌发的抑制物质.射干种皮浸取液处理小麦种子后,38 h内明显抑制小麦种子萌发,且对小麦种子的萌发具有延后作用;并显著抑制小麦幼苗植株和根的生长,且浸提液浓度越高,对小麦种子萌发的延后作用以及抑制幼苗株高和根系生长的影响越明显.射干胚乳浸提液对小麦种子萌发和幼苗生长无显著影响.射干种子种皮内存在种子萌发抑制物,该抑制物具有延缓种子萌发和抑制幼苗生长的作用.     

滇重楼种子休眠类型的研究

以石蜡切片法、抑制物生物鉴定法及对比分析法开展滇重楼种子休眠类型的研究。结果表明,滇重楼果实成熟时胚发育不完整,停留于球形胚阶段,胚的发育程度在果实成熟后不受采收时间的影响;滇重楼种子能正常吸水,不存在由于透水性差而引发的休眠;滇重楼外种皮和胚乳的水浸提液对小白菜种子具有强烈的抑制作用;带外种皮的滇重楼种子在适宜萌发的条件下种子萌发时间显著延后,滇重楼外种皮抑制胚的形态后熟。基于研究结果,认为滇重楼种子休眠类型为综合性休眠。     

腊肠树种子休眠与解除的方法研究

[目的]探讨腊肠树种子休眠与解除的方法。[方法]通过热水浸泡、机械脱种皮、设置不同KNO3和GA3溶液浓度,分别对腊肠树种子进行处理,探讨解除腊肠树种子休眠的方法。对种子周围的胶质以及包围种胚的种皮分别进行研磨、浸提,测定其提取液对白菜种子发芽率的影响。[结果]95℃热水和机械脱种皮处理的腊肠树种子的发芽最好,能有效解除种子休眠。而KNO_3和GA_3浸种对种子萌发和休眠解除没有明显效果。腊肠树果实中存在抑制种子萌发和使种胚处于休眠状态的抑制物。[结论]该研究可为进一步探讨腊肠树种子休眠机制提供参考。     

中国冬小麦区域试验品种抗病性评价

【目的】明确中国小麦主要后备品种和高代品系对条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病、黄矮病的抗性程度和水平,为培育抗病新品种、品种审定与推广、抗病品种合理布局、降低品种抗性“丧失”风险提供依据。【方法】以中国小麦条锈菌流行小种条中32（CYR32）、条中33号（CYR33）等、叶锈菌PHT、THT等、秆锈菌21C3、34C2等、对15个已知抗白粉病基因具有毒性的白粉菌混合菌系、赤霉病菌、纹枯病菌强毒力菌株和BYDV-GAV株系对1999-2014年度国家小麦区域试验品种（系）1 815份次试验材料进行成株期人工接种抗性鉴定,重要材料连续进行两年试验,以确保结果的重复和可靠。【结果】在所鉴定的品系中,具有3种抗病性以上的品种（系）共250个,通过农业部国家农作物品种审定委员会审定的品种共310个;中抗和高抗条锈病品种占参试品种的（39.8±21.7）%、中感和高感品种占（39.7±27.9）%;赤霉病、纹枯病、秆锈病和白粉病抗病品种所占比例分别为（31.5±27.5）%、（31.1±35.6）%、（48.2±25.6）%和（25.0±14.6）%、感病品种分别占（68.5±27.5）%、（62.2±38.6）%、（31.3±20.7）%和（70.7±14.6）%;抗叶锈病品种比例仅为（9.9±3.8）%,感病品种高达（70.4±15.1）%;除河农831表现中抗外,所有品种对黄矮病均表现感病,未出现高抗品种。【结论】抗源缺乏的病害未鉴定出抗性强的品种,抗条锈病和白粉病品种主要出现在甘肃、四川等地,抗叶锈小麦品种（系）较少。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。     

几株共同发酵水产下脚料菌株的筛选及鉴定

目前水产下脚料不能得到合理利用,被大量废弃。本研究筛选几株能高效发酵水产下脚料的菌株,分解下脚料产生游离态氮、磷、钾等植物所需营养素。从市售微生物肥料、土壤、腐败鱼体中的微生物分离出44株菌,分别进行单一发酵水产下脚料实验、解磷解钾固氮实验、协同拮抗实验以确定能较好共同发酵水产下脚料的菌株;并通过建立聚类树,结合菌株形态学、生理生化特点,推断菌株的生物属性。最终筛选得到的4株菌分别为,GP2食酸菌、GS4假单胞菌、ZP1黑曲霉和ZP3酵母菌。筛选确定的4株菌,具有较好的发酵水产下脚料产生氮、磷、钾等植物所需营养素的能力,且4株菌作用的发酵液中氮、磷、有机质含量均超过国家微生物肥料标准,这4株菌可以用于水产下脚料发酵。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。     

家蚕CDK11与RNPS1和9G8相互作用的鉴定

【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6.0构建系统进化树,通过免疫荧光验证家蚕CDK11两种剪切体CDK11A和CDK11B分别与RNPS1和9G8的共定位情况,进一步通过免疫共沉淀验证CDK11A、CDK11B分别与RNPS1和9G8的相互作用。【结果】RNPS1的开放阅读框长为882 bp,编码293个氨基酸;9G8的开放阅读框长为531 bp,编码176个氨基酸;RNPS1和9G8都属于SR蛋白家族,具有该蛋白家族成员的一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域。同源序列比对表明,RNPS1和9G8都具有典型的RRM结构域,此外9G8还含有一个锌指结构域。系统进化分析显示,RNPS1聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的斑点木蝶、黑脉金斑蝶等亲缘关系较近;9G8也聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的黑脉金斑蝶、金凤蝶等关系较近。荧光共定位证明,RNPS1分别与CDK11A和CDK11B共定位于细胞核中,且具有点状共聚集现象;同时发现,RNPS1还具有胞质定位,点状聚集于核外周。而9G8分别与CDK11A、CDK11B在细胞核中也具有共定位现象。进一步通过免疫共沉淀发现,在所有的总蛋白和细胞裂解离心后的上清液样品中,均能检测到对应目的条带的表达,表明共转染的细胞均能正常表达目的蛋白,并且蛋白溶于上清。同时,在所有的共沉淀条带中,均能检测到对应目的条带,以上结果表明CDK11A、CDK11B均与RNPS1和9G8具有相互作用。【结论】家蚕RNPS1和9G8具有典型的RRM结构域,属于SR家族。CDK11A和CDK11B能够与RNPS1和9G8相互作用。     

野生樱桃李对北方根结线虫和花生根结线虫的抗性

为探明野生樱桃李抗根结线虫种质资源的价值,以实生钵苗为试材,采用人工接种等方法,研究其对北方根结线虫和花生根结线虫的抗性.结果表明:接种后30 d,野生樱桃李根系中北方根结线虫、花生根结线虫的雌成虫数量分别占2龄线虫接种量的0.16％和0.03％,依据抗性评价标准判定其高抗北方根结线虫和花生根结线虫;接种北方根结线虫的群体中包含免疫、高抗和中抗3种类型,分别占群体总数的46％、48％和6％;接种花生根结线虫的包含免疫和高抗2种类型,分别占群体总数的56％和44％;接种北方根结线虫和花生根结线虫的植株未被侵染率分别为46％和52％,所有供试植株根系表面均未发现线虫卵块.野生樱桃李高抗北方根结线虫和花生根结线虫,其对北方根结线虫、花生根结线虫的抗性均存在显著的株间分离现象;抗侵入、抗发育和抗繁殖是其对北方根结线虫和花生根结线虫的主要抗性机制;野生樱桃李是抗根结线虫核果类果树砧木种质资源树种.     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

【目的】MYBA1转录因子在花色苷生物合成中扮演着重要角色,通过对葡萄果实发育过程中VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR的表达和花色苷的积累模式以及VvMYBA1与VvUFGT、VvDFR作用机制的分析,阐明花色苷合成调控机制。【方法】利用实时荧光PCR检测VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中的表达模式;采用分光光度计测定葡萄中花色苷积累量的变化规律;用SAS8.0软件分析VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR不同时期表达量及花色苷积累量之间的相关性;通过酵母杂交系统检测VvMYBA1转录激活活性及其与VvUFGT、VvDFR间的作用。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中呈现先上升后下降的趋势,在转色期（花后60-80 d）达到最大值。葡萄果实发育过程中花色苷积累量表现为先上升后趋于稳定,转色期（花后80 d）达到最大值。相关性分析结果表明,VvMYBA1表达量与VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,花色苷积累量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关。酵母杂交系统检测表明,VvMYBA1具有转录激活功能,能够特异结合VvUFGT、VvDFR启动子,与VvUFGT、VvDFR编码的蛋白不具有相互作用。【结论】花色苷含量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,VvMYBA1具有转录激活功能且能特异性结合VvUFGT、VvDFR的启动子,表明VvMYBA1通过激活VvUFGT、VvDFR的启动子来调节其表达,从而调控花色苷的合成积累。