等渗透势盐分和水分胁迫对白刺幼苗生长及离子吸收分配的影响

研究了等渗透势(-0.79、-1.83 MPa)盐分胁迫(NaCl)和水分胁迫(PEG)对西伯利亚白刺(Nitraria sibirica)幼苗生长及不同组织离子吸收分配的差异,探讨白刺抗旱和耐盐的相互关系。结果表明,与对照相比,-1.83 MPa NaCl和PEG处理后白刺幼苗的株高、茎粗、主根长和干物重均极显著(P＜0.01)降低,可溶性糖、脯氨酸和丙 二醛含量均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)升高,其中NaCl对幼苗生长的抑制作用显著(P＜0.05)大于PEG处理。不同器官离子含量,NaCl各处理的白刺幼苗Na⁺含量均上升,K⁺含量均先升后降,Ca²⁺、Mg²⁺含量及K⁺/Na⁺、Ca²⁺/Na⁺和Mg²⁺/Na⁺值均下降;PEG各处理的白刺幼苗Na⁺含量均先降后升,K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量均下降,K⁺/Na⁺、Ca²⁺/Na⁺和Mg²⁺/Na⁺值均先升后降。不同器官离子的变化幅度以根中最大,茎次之,叶中最小。白刺幼苗主要是通过盐离子的区域化分布和调节幼苗体内的离子平衡来抵抗盐害的,通过积累大量有机小分子物质来抵抗旱害的。     

盐氮处理下盐地碱蓬种子成熟过程中的离子积累和种子萌发特性

研究了盐氮处理条件下盐地碱蓬种子成熟过程中的离子积累以及种子萌发特性,以理解盐地碱蓬在种子发育及萌发过程中对高盐低氮生境的适应性。结果表明,种子成熟过程中,不同浓度盐氮处理下(0.5和5 mmol/L NO₃^--N;1和500 mmol/L NaCl),与果皮和果枝相比, 胚中Na⁺、K⁺、Cl^- 和NO₃^-离子含量几乎没有变化。所有盐氮处理下Na⁺ 和Cl^-都是果皮和果枝中高于胚中,尤其是在高盐处理下。高盐处理下,K⁺ 和NO₃^-含量呈现相反的趋势。高氮时无论高盐还是低盐,果皮中NO₃^-离子含量高于胚中,而果枝中NO₃^-离子含量低于胚中。而低氮时果皮及果枝中NO₃^-离子含量均显著低于胚中。与高氮环境下收获的种子相比,低氮环境下收获的种子萌发率,萌发指数,活力指数都要明显高。上述结果说明,盐地碱蓬种子成熟过程中存在完善的离子调控机制,保护胚免受Na⁺ 和Cl^-等有害离子的伤害并且促进K⁺ 和NO₃^-等营养离子的积累。低NO₃^--N下收获的种子对外界的NO₃^-含量比较敏感,施以较高浓度的NO₃^-能够促进种子萌发,提高萌发指数和活力指数,可能与盐地碱蓬长期适应高盐低氮生境有关。     

NaCl胁迫下黑果枸杞幼苗生长及Na+、K+吸收与分配的变化

以黑果枸杞组培苗为试材,研究7 d和20 d NaCl胁迫对其生长和Na^{+、K+吸收分配的影响。结果表明：7 d低浓度（50~150 mmol/L）NaCl处理下,黑果枸杞幼苗的株高、根长和各器官的生物量明显增加,生长得到显著促进。20 d NaCl处理下,上述指标较对照均下降,但在150~300 mmol/L NaCl处理组间维持相对稳定。不同浓度NaCl处理下,各器官中Na+浓度及Na+净吸收速率持续上升,且20 d较7 d处理各指标略有增加;K+浓度、K+净吸收速率和K+/Na+均有所下降,且20 d处理下的下降幅度远高于7 d,但随浓度增加,均能在200~300 mmol/L NaCl处理组间维持相对稳定。此外,Na+和K+在各器官中的相对分配一致,均集中分配在叶中,且在50~250 mmol/L NaCl下与对照没有差异。可见,黑果枸杞具有较强的耐盐性,适度NaCl(0~150 mmol/L) 能促进其生长,通过维持K+净吸收速率,保障各器官中相对稳定的K+浓度和K+/Na+,并将Na+和K+更多地分配在叶中,这是黑果枸杞维持较强耐盐性的重要适应机制之一。}     

NaCl胁迫下甜瓜苗期CmCBL1的表达及生理响应

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL作为钙感受器,接收外界刺激传递钙信号给下游的靶蛋白,从而引起一系列生理生化反应,在植物生长和抗逆方面有重要作用。研究以1/2 Hogland营养液水培甜瓜幼苗为材料,对其进行0 mmol/L(CK)和200 mmol/L NaCl处理,分析盐胁迫下0~9 d不同时间点甜瓜幼苗中CmCBL1基因的表达变化与植株生理生化指标变化。结果表明,CmCBL1基因主要在甜瓜的茎和叶表达,并且在NaCl胁迫处理(200 mmol/L)下0~12 h内上调表达后下降。与对照相比,NaCl胁迫处理甜瓜幼苗干质量与鲜质量都下降,根、茎、叶的Na⁺/K⁺均升高,叶片黄化。Spearman相关性分析结果表明,相对于对照植株,在第3~7天时间点内盐胁迫下CmCBL1相对表达与Na⁺/K⁺、Na⁺相对含量呈极显著负相关,与鲜质量呈显著正相关,综上说明CmCBL1基因在甜瓜耐盐生理中具有重要作用。     

艾比湖流域风沙土盐分特征分析

以艾比湖流域风沙土土壤为研究对象,对不同植被类型覆盖条件下土壤总盐含量、可溶性离子等指标进行测定,通过相关性分析以及主成分分析,确定土壤盐分特征。结果表明：研究区不同植被覆盖下的风沙土土壤盐分含量较高,差异较大,总盐含量呈现强烈的空间变异特征;土壤中总盐含量与Cl^-、K⁺+Na⁺及SO₄^2-含量之间存在极显著的正相关关系,总盐含量与HCO₃^-的相关性最弱;土壤中阴离子以Cl^-,SO₄^2-为主,阳离子以K⁺+Na⁺为主,据主成分分析结果将其确定为盐渍化的特征因子。研究区风沙土盐渍化类型以氯化物-硫酸盐型和硫酸盐型为主,判断该区域风沙土的盐渍化类型为盐土。     

博斯腾湖西岸湖滨带土壤剖面盐分特征分析

以博斯腾湖西岸湖滨带为研究区,采集三个时期不同土壤剖面样品,结合样品实验分析,探究土壤盐分特征。研究结果表明：(1) 0～10 cm土层中平均盐分含量为3.919 g·kg^-1,土壤盐分表聚现象强烈; (2) 垂直方向上盐分离子中Mg²⁺变异系数为1.034,变化程度较大,HCO₃^-变异系数为0.080,变化程度较小; (3) 通过相关分析,硫酸盐与氯化物在表土中积聚强烈,其中SO₄^2-与Na⁺+K⁺之间相关系数为0.96,Cl^-与Mg²⁺相关系数为0.79;Cl^-和Na⁺+K⁺相关系数为0.72; (4) 通过对比柽柳剖面下土壤盐分含量,夏秋两个季节土壤剖面土壤盐分呈现明显的表聚现象,0～10 cm土层中盐分含量占总体的27.37%和21.88%,春季盐分在剖面上呈现强烈的底聚现象,90～100 cm土层盐分含量占总体的21.53%; (5) 对比不同植被下土壤盐分特征,裸地、草地、林地、耕地四种地表类型土壤中(Na⁺+K⁺)∶Mg²⁺∶Ca²⁺含量之比依次为85∶2.5∶1,16∶2.5∶1,9∶0.9∶1,10∶1.3∶1,裸地中Ca²⁺含量为0.104 g·kg^-1,明显高于其它植被类型中Ca²⁺含量;Na⁺+K⁺含量差异不大,平均含量为1.181 g·kg^-1;草地中Mg²⁺平均含量为0.081 g·kg^-1,是裸地中Mg²⁺含量的4.4倍。     

土壤盐分离子对乌鲁木齐小白菜Pb含量的影响研究

为研究土壤中盐分离子对小白菜Pb含量的影响,采取正交试验L₁₆ 4⁵和盆栽试验方法,分析了5种阳离子（Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Pb²⁺）和3种阴离子（SO₄^2-、Cl^-、NO₃^-）对小白菜地上部和根系中Pb含量的影响。结果表明,试验条件下小白菜地上部Pb含量为0.215~0.930 mg·kg^-1,根系中Pb含量为1.648~24.33 mg·kg^-1,可食用部分超标率达81.3%。土壤盐分离子对小白菜地上部Pb含量影响顺序为： Ca²⁺ > Mg²⁺ > Na⁺ > Pb²⁺ > K⁺。根据相关性分析,土壤中Ca²⁺与小白菜地上部Pb含量呈显著负相关（r=-0.540 3,P<0.05）,Na⁺和Pb²⁺呈正相关但不显著。Mg²⁺和K⁺呈负相关,也不显著。Cl^-和NO₃^-与小白菜地上部Pb含量呈显著负相关（r=-0.540,P<0.05）,SO₄^2-呈正相关,但不显著。对小白菜根系Pb含量影响顺序为： Pb²⁺ > K⁺ > Na⁺ > Ca²⁺ > Mg²⁺,土壤中Pb²⁺对小白菜根系Pb的含量呈显著正相关（r=0.483,P<0.05）,Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、SO₄^2-、Cl^-和NO₃^-相关性不显著。乌鲁木齐土壤中固有的盐分离子对小白菜可食用部分Pb的吸收没有抑制作用。     

香梨两种树形净光合速率特征及影响因素

以自然开心形和疏散分层形香梨树为试材,应用美国Li-cor公司生产的Li-6400光合作用测定系统测定其光合参数,分析了香梨两种不同树形叶片的光合特性以及叶片叶绿素含量、比叶重(SLW)与净光合速率(Pn)的关系,同时研究了气孔导度(Gs)、胞间CO₂浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)及其它因子对不同树形Pn的影响。结果表明:自然开心形和疏散分层形香梨树叶片Pn日变化呈不对称双峰曲线,14:00左右出现光午休现象,且整个生长期疏散分层形香梨树叶片Pn峰值大于自然开心形,6月份Pn最小,这与气孔的调节作用密切相关。疏散分层形Pn日变化在11:00 和15:30出现高峰,自然开心形Pn日变化高峰出现在11:00和17:00;同一品种同一时期的自然开心形树和疏散分层形树的叶绿素含量与其Pn值呈正相关,R²分别为0.9438和0.8952;自然开心形的Pn与SLW的相关性高于疏散分层形;Gs、Tr、RH与Pn呈正相关,与Ci、Cs和Pn呈负相关,且疏散分层形香梨树叶片的Pn与Gs、Tr和Cs的相关性均达到了极显著水平,与Ci、Ta、PAR和Hs均达到了显著水平,而在自然开心形中Pn与光合参数相关性不明显,这说明疏散分层形香梨树对影响光合作用的外界因素和内部因素的变化反应比自然开心形敏感。     

广州大夫山雨季林内外空气TSP和PM2.5浓度及水溶性离子特征

采用平行同步采样法,于2012年雨季,对广州市大夫山森林公园林内外空气的总悬浮颗粒物(TSP)和细颗粒物(PM_2.5)样品进行了24 h收集,测定了TSP和PM_2.5的质量浓度并分析了样品中水溶性无机离子成分。结果表明:林内外PM_2.5的质量浓度平均值分别为(40.18±10.47)和(55.79±13.01) g/cm³;林内外TSP的质量浓度分别为(101.32 ± 33.19)和(116.61±35.36) g/cm³。林内与林外比,PM_2.5和TSP平均质量浓度都显著减少(P < 0.05),表明森林能显著改善空气环境质量。TSP和PM_2.5中SO₄^2-、Na⁺、NH₄⁺和NO₃^-为水溶性无机离子主要成分,占总离子质量的80%以上,林外这些离子的浓度高于林内(NH₄⁺除外)。这4种离子雨季在空气中的主要存在方式为NaCl、Na₂SO₄、NH₄HSO₄和NH₄NO₃。计算表明,采样期间海盐对大夫山空气TSP和PM_2.5的水溶性组分中Na⁺和Cl^-贡献最大,其它元素主要源自陆地源。林内外TSP和PM_2.5的c(NO₃^-)/c(SO₄^2-)比值在0.3以下,表明固定源是大夫山森林公园空气主要污染贡献者,TSP中c(NO₃^-)/c(SO₄^2-)的比值大于PM_2.5的比值,说明移动源对TSP的贡献大于PM_2.5。     

珍稀药用植物白及光合与蒸腾生理生态及抗旱特性

以珍稀濒危药用植物白及(Bletilla striata)叶片为研究对象,应用Li-6400XT便携式光合仪分别在晴天和阴天进行光合生理生态特性研究。结果显示晴天Gs、Pn、Tr日变化呈现双峰型,阴天为单峰型;光合-蒸腾具有极显著线性正相关关系与良好的线性耦合关系(晴天和阴天的相关系数分别为0.883^**、0.954^**,回归直线斜率分别为2.38、3.78);PAR-Pn与PAR-Tr、Tl-Pn与Tl-Tr、Gs-Pn与Gs-Tr 的回归直线形态非常相似,除晴天Tl与Pn外,其余两两相关关系均达到了显著水平;PAR、Tl和Gs三个因子与Pn、Tr均表现为正相关关系,其中Gs是调控Pn与Tr的最主要因子。进行聚乙二醇6000(PEG6000) 渗透胁迫实验以评价白及抗旱能力,分析不同质量分数PEG6000(0、5、20、40、60g/L)下的白及幼苗叶绿素含量、叶片含水量、相对电导率3个生理指标,结果表明叶绿素含量与与胁迫浓度呈负相关(R²=0.7854),随着PEG质量分数的增加,叶片的叶绿素含量持续显著下降;叶片含水量与胁迫浓度呈负相关(R²=0.9936);相对电导率与与胁迫浓度呈正相关(R²=0.8755),相对电导率会随着PEG质量分数的增加而显著增加。试验结果综合分析显示白及为耐荫植物,抗旱能力不强。白及进行人工栽培应适当遮阴保持土壤与空气湿度。     

中国冬小麦区域试验品种抗病性评价

【目的】明确中国小麦主要后备品种和高代品系对条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病、黄矮病的抗性程度和水平,为培育抗病新品种、品种审定与推广、抗病品种合理布局、降低品种抗性“丧失”风险提供依据。【方法】以中国小麦条锈菌流行小种条中32（CYR32）、条中33号（CYR33）等、叶锈菌PHT、THT等、秆锈菌21C3、34C2等、对15个已知抗白粉病基因具有毒性的白粉菌混合菌系、赤霉病菌、纹枯病菌强毒力菌株和BYDV-GAV株系对1999-2014年度国家小麦区域试验品种（系）1 815份次试验材料进行成株期人工接种抗性鉴定,重要材料连续进行两年试验,以确保结果的重复和可靠。【结果】在所鉴定的品系中,具有3种抗病性以上的品种（系）共250个,通过农业部国家农作物品种审定委员会审定的品种共310个;中抗和高抗条锈病品种占参试品种的（39.8±21.7）%、中感和高感品种占（39.7±27.9）%;赤霉病、纹枯病、秆锈病和白粉病抗病品种所占比例分别为（31.5±27.5）%、（31.1±35.6）%、（48.2±25.6）%和（25.0±14.6）%、感病品种分别占（68.5±27.5）%、（62.2±38.6）%、（31.3±20.7）%和（70.7±14.6）%;抗叶锈病品种比例仅为（9.9±3.8）%,感病品种高达（70.4±15.1）%;除河农831表现中抗外,所有品种对黄矮病均表现感病,未出现高抗品种。【结论】抗源缺乏的病害未鉴定出抗性强的品种,抗条锈病和白粉病品种主要出现在甘肃、四川等地,抗叶锈小麦品种（系）较少。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。     

几株共同发酵水产下脚料菌株的筛选及鉴定

目前水产下脚料不能得到合理利用,被大量废弃。本研究筛选几株能高效发酵水产下脚料的菌株,分解下脚料产生游离态氮、磷、钾等植物所需营养素。从市售微生物肥料、土壤、腐败鱼体中的微生物分离出44株菌,分别进行单一发酵水产下脚料实验、解磷解钾固氮实验、协同拮抗实验以确定能较好共同发酵水产下脚料的菌株;并通过建立聚类树,结合菌株形态学、生理生化特点,推断菌株的生物属性。最终筛选得到的4株菌分别为,GP2食酸菌、GS4假单胞菌、ZP1黑曲霉和ZP3酵母菌。筛选确定的4株菌,具有较好的发酵水产下脚料产生氮、磷、钾等植物所需营养素的能力,且4株菌作用的发酵液中氮、磷、有机质含量均超过国家微生物肥料标准,这4株菌可以用于水产下脚料发酵。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

【目的】MYBA1转录因子在花色苷生物合成中扮演着重要角色,通过对葡萄果实发育过程中VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR的表达和花色苷的积累模式以及VvMYBA1与VvUFGT、VvDFR作用机制的分析,阐明花色苷合成调控机制。【方法】利用实时荧光PCR检测VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中的表达模式;采用分光光度计测定葡萄中花色苷积累量的变化规律;用SAS8.0软件分析VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR不同时期表达量及花色苷积累量之间的相关性;通过酵母杂交系统检测VvMYBA1转录激活活性及其与VvUFGT、VvDFR间的作用。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中呈现先上升后下降的趋势,在转色期（花后60-80 d）达到最大值。葡萄果实发育过程中花色苷积累量表现为先上升后趋于稳定,转色期（花后80 d）达到最大值。相关性分析结果表明,VvMYBA1表达量与VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,花色苷积累量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关。酵母杂交系统检测表明,VvMYBA1具有转录激活功能,能够特异结合VvUFGT、VvDFR启动子,与VvUFGT、VvDFR编码的蛋白不具有相互作用。【结论】花色苷含量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,VvMYBA1具有转录激活功能且能特异性结合VvUFGT、VvDFR的启动子,表明VvMYBA1通过激活VvUFGT、VvDFR的启动子来调节其表达,从而调控花色苷的合成积累。     

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。     

家蚕CDK11与RNPS1和9G8相互作用的鉴定

【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6.0构建系统进化树,通过免疫荧光验证家蚕CDK11两种剪切体CDK11A和CDK11B分别与RNPS1和9G8的共定位情况,进一步通过免疫共沉淀验证CDK11A、CDK11B分别与RNPS1和9G8的相互作用。【结果】RNPS1的开放阅读框长为882 bp,编码293个氨基酸;9G8的开放阅读框长为531 bp,编码176个氨基酸;RNPS1和9G8都属于SR蛋白家族,具有该蛋白家族成员的一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域。同源序列比对表明,RNPS1和9G8都具有典型的RRM结构域,此外9G8还含有一个锌指结构域。系统进化分析显示,RNPS1聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的斑点木蝶、黑脉金斑蝶等亲缘关系较近;9G8也聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的黑脉金斑蝶、金凤蝶等关系较近。荧光共定位证明,RNPS1分别与CDK11A和CDK11B共定位于细胞核中,且具有点状共聚集现象;同时发现,RNPS1还具有胞质定位,点状聚集于核外周。而9G8分别与CDK11A、CDK11B在细胞核中也具有共定位现象。进一步通过免疫共沉淀发现,在所有的总蛋白和细胞裂解离心后的上清液样品中,均能检测到对应目的条带的表达,表明共转染的细胞均能正常表达目的蛋白,并且蛋白溶于上清。同时,在所有的共沉淀条带中,均能检测到对应目的条带,以上结果表明CDK11A、CDK11B均与RNPS1和9G8具有相互作用。【结论】家蚕RNPS1和9G8具有典型的RRM结构域,属于SR家族。CDK11A和CDK11B能够与RNPS1和9G8相互作用。     

三种本地赤眼蜂对大豆食心虫卵的寄生潜能

【目的】大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella Matsumura）是中国北方大豆生产上的最重要蛀荚害虫,研究旨在明确3种本地赤眼蜂即黏虫赤眼蜂（Trichogramma leucaniae ）、玉米螟赤眼蜂（T. ostriniae）和螟黄赤眼蜂（T. chilonis）对自然寄主大豆食心虫卵的寄生潜能,为选育优良蜂种、定量评估赤眼蜂对大豆食心虫的控害潜能提供科学依据。【方法】 在室内采用编制以米蛾卵为中间寄主繁育的3种赤眼蜂在大豆食心虫卵上的实验种群生命表的方法,比较分析其在大豆食心虫卵上的繁殖特性以及净增殖率（R₀）、平均世代周期（T）、内禀增长率（rm）、周限增长率（λ）、平均单雌寄生卵数、雌蜂平均寿命和羽化率等寄生特性参数。【结果】螟黄赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂和黏虫赤眼蜂在羽化当日均达到产卵高峰,分别占其总产卵量的68.1%、69.1%和64.0%,随着时间的延长,螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂的产卵量呈明显下降趋势,在无任何营养补给时,10.0%的黏虫赤眼蜂雌蜂个体可存活7 d,羽化3 d后,平均单雌寄生10.5粒大豆食心虫卵,占总寄生量的22.5%;黏虫赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂的R₀、T、rm和λ分别为24.75、23.78和21.13;9.46、10.34和10.37 d;0.3393、0.3064和0.2941;1.4040、1.3585和1.3419;而3种供试赤眼蜂的平均单雌寄生卵数、平均寿命以及在大豆食心虫卵上的羽化率均无显著差异。综合比较结果显示,黏虫赤眼蜂在大豆食心虫卵上的各项实验种群生命表参数（R₀、T、rm和λ）最好,其次是螟黄赤眼蜂,玉米螟赤眼蜂的表现最差。【结论】黏虫赤眼蜂对大豆食心虫卵有较强的嗜好性和适应性,其主要生殖力特征参数均优于螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂,是寄生大豆食心虫卵的优势蜂种,具有较大的应用前景。