克隆整合对入侵杂草空心莲子草和本土莲子草生长及光合性能的影响

目的 在我国，外来入侵植物空心莲子草Alternanthera philoxeroides常与本地莲子草 A. sessilis同域分布且占据生态优势。本文探讨克隆整合与空心莲子草强竞争力间的关系。方法 通过同质园试验，对空心莲子草和莲子草先端与基端匍匐茎的连接处进行保持连接(克隆整合)与剪断处理(无克隆整合)，分别测量不同克隆整合处理下2种植物先端分株、基端分株及整个克隆片段地上部分及根系的生长、光合性能及生物量分配情况，比较2种植物克隆整合能力的大小。结果 克隆整合处理下，空心莲子草先端分株的茎长、基端分株的叶片数及整个克隆片段的叶片数及茎长显著增加，细根数、总根数及一些光合指标(如光补偿点、气孔导度等)也显著提高；莲子草先端分株、基端分株及整个克隆片段的地上(下)生物量、总生物量、粗(细)根数及总根数也显著增加。克隆整合处理下空心莲子草先端分株、基端分株或整个克隆片段的地上(下)生物量、总生物量及一些光合指标(如净光合速率、蒸腾速率、气孔导度)显著高于莲子草。结论 空心莲子草和莲子草均能在一定程度上从克隆整合中受益，但空心莲子草的克隆整合能力要显著强于本地莲子草，能通过克隆整合作用挤占莲子草的空间生态位，从而形成自然生境中的竞争优势。     

不同氮磷比条件下结缕草克隆整合作用的生长代价与收益

为了解结缕草克隆整合作用的生长代价与收益,及其与土壤氮磷比的关系,以克隆植物结缕草(Zoysia japonica)为研究对象,研究了对主匍匐茎实施4种切断处理(连接、轻度切断、中度切断和重度切断)和3种氮磷比(N∶P2O5=7∶1、N∶P2O5=14∶1、N∶P2O5=21∶1)处理对结缕草植株生长和生物量积累的影响,并进行生长代价与收益的分析。结果表明:无论在何种氮磷比条件下,与主匍匐茎连接相比,不同程度的切断处理均显著降低结缕草克隆植株的一级A分株数、复合节数和主匍匐茎的长度、生物量及其生物量分配,显著增加一级B分株数、二级A、B分枝数、母株生物量和A、B分枝生物量分配。结缕草克隆植株对根系生物量的分配随氮磷比的升高而增大,对A分枝的生物量分配(25.7%~47.6%)始终高于对B分枝的生物量分配(3.9%~16.5%)。结缕草在低氮磷比(N∶P2O5=7∶1)生境中,生长最为适宜,积累的总生物量显著高于中、高氮磷比生境。在任何氮磷比养分条件下,分别对主匍匐茎实施中度切断、轻度切断和不切断(连接)处理时,其克隆植株总生物量分别为3.65 g、2.90 g和2.94 g,均高于重度切断处理。因此,结缕草的克隆整合作用在不同切断处理间存在不同程度的生长代价与收益,长期而完整的克隆整合使结缕草克隆植株的一级A分株、复合节和匍匐茎的生长显著受益,而一级B分株、二级A、B分枝和母株的生长则出现明显的损耗。     

光照和水分交互斑块性生境中蛇含萎陵菜的克隆内分工

以匍匐茎克隆植物蛇含萎陵菜(Potentilla kleinianaW)为对象,研究其在高光照低水分斑块和低光照高水分斑块组成的资源交互斑块性生境中的克隆内分工。结果显示,当保持生长于高光照低水分条件下(HL)分株与生长于低光照高水分条件下(LH)分株之间的匍匐茎连接时,蛇含萎陵菜植株的HL分株、LH分株以及整个分株对系统的生物量均获得显著增加;蛇含萎陵菜植株的HL分株根冠比显著小于切断分株间连接时HL分株的根冠比;蛇含萎陵菜植株的LH分株根长显著大于切断分株间连接时LH分株根长;蛇含萎陵菜植株的HL分株叶面积显著大于切断分株间连接时HL分株叶面积。结果显示,资源交互斑块性生境中蛇含萎陵菜通过生物量分配格局以及资源吸收结构特化发生了克隆内分工,通过分工克隆植物能有效地利用异质性分布的资源,具有重要的生态适应意义。     

花期海蓬子对盐胁迫的生理响应

研究了花期阶段不同浓度NaCl(0、10‰、20‰、30‰、40‰、50‰和60 ‰)对海蓬子(Salicornia bigelovii)生长、光合色素、光合作用参数、抗氧化和离子含量的影响。结果表明:10‰NaCl盐处理下海蓬子株高、茎生物量、叶绿素(Chl)含量、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO₂浓度(Ci)、茎SOD活性和POD活性等指标值均显著高于其它处理,而高盐(40‰NaCl及其以上)胁迫下,上述指标值均表现为下降,同时茎K⁺ 含量也显著下降,而茎Na⁺、Cl^-、Na⁺/K⁺和MDA含量等显著上升。相关分析显示,生物量与Chl a/Chl b呈现显著正相关,与株高、茎Pn、Gs、Ci、Tr、Chl含量、K⁺ 含量、SOD和POD活性呈现极显著正相关,与气孔限制值(Ls)、Car/Chl、MDA含量、Cl^- 含量和Na⁺/K⁺ 等均呈极显著负相关。综上所述,10‰ NaCl处理是花期海蓬子生长和光合生长的最适宜盐度,而无盐和高盐下海蓬子光合抑制主要是来自气孔因素,同时高盐胁迫下还伴随着非气孔限制。     

遮荫对青钱柳苗生长和黄酮类化合物积累的影响

青钱柳（Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja）是我国特有的木本药用植物,含有益人体健康的黄酮类化合物。光照条件影响植物次生代谢物的合成和积累。为探索遮荫对青钱柳黄酮类化合物积累和生长的影响,在合肥市林业高科技开发中心的苗圃内,以2年生青钱柳苗为对象,设置全光、50%遮阳率遮阳网一层遮荫（光照强度约为全光下的42%）、50%遮阳率遮阳网二层遮荫（光照强度约为全光下的19%）3种光照强度处理。结果表明：随光照强度的下降,青钱柳苗高和地径生长及生物量积累显著下降,生物量分配发生可塑性变化,根冠比显著下降,净光合速率下降,青钱柳苗的叶绿素含量提高,PSⅡ原初光能转换效率（F_v/F_m）和PSⅡ光能捕获效率（F_v′/F_m′）提高。随遮荫程度的加深,青钱柳体内的总黄酮和黄酮单体含量明显下降,叶片中总黄酮和黄酮单体的产量不断下降。黄酮类化合物在叶片中的积累模式也发生适应性变化,强光下黄酮类化合物主要积累在叶片的上表皮和主脉的微管组织中。研究植株次生代谢物积累与生长对光照条件变化的响应,对于探究提高药用植物产量的栽培管理技术具有重要意义。     

极端干旱区多枝柽柳幼苗对人工水分干扰的形态及生理响应

在塔里木河下游断流河道人工生态输水的大背景下,多枝柽柳(Tamarix ramosissima )作为当地优势物种,其更新恢复研究对下游荒漠河岸林的恢复尤为重要。通过研究多枝柽柳幼苗形态、水分和光合生理对不同灌溉处理的响应,分析不同人工水分干扰模式对柽柳幼苗生长发育的影响。实验设计了侧渗分层(LSI)和地表灌溉(AGI)两种给水方式,以及高灌(W1,50 L/株)、中灌(W2,25 L/株)、低灌(W3,12.5 L/株)3 个给水水平,并在整个生长季定期监测幼苗的形态参数变化、生物量、水势和光合速率。结果显示:(1)侧渗分层灌溉方式对幼苗基径、株高、冠幅以及前期生长速率都有促进作用;(2)在侧渗分层灌溉高灌下,幼苗地下及总生物量都显著高于地表灌溉(P < 0.05),且地表灌溉下根冠比(R/S:Root shoot ratio)明显高于侧渗分层灌溉;(3)侧渗分层灌溉下,幼苗茎水势高于地表漫灌,且在中灌和低灌下达到显著水平(P < 0.05),表明侧渗分层灌溉下幼苗的水分吸收效率更高;(4)在侧渗分层高灌及中灌下,实际光化学光量子产量值高于地表灌溉处理,并在高灌时差异极显著(P < 0.01)。研究表明,侧渗分层灌溉方式对多枝柽柳幼苗早期生长及水分和光合生理都具有显著促进作用。     

克隆整合对结缕草与狗牙根种间竞争的影响研究

以结缕草(Zoysia japonica Steud.)为研究对象,选取狗牙根[Cynodon dactylon (L.)Pars.]为竞争种,在盆栽条件下,通过切断或保持其基端分株与先端分株间的匍匐茎连接,研究了克隆整合对结缕草先端分株生长及竞争力的影响.结果表明,克隆整合显著提高了结缕草先端分株的分株数、根数量和生物量,并降低了其对叶的生物量投资.种间竞争显著降低了结缕草的生长,并显著提高了根生物量分配.当具有相似克隆生长习性的狗牙根的竞争存在时,克隆整合作用不能提高结缕草先端分株的竞争力,狗牙根的存在较强地抑制了结缕草生长.     

红颜草莓不同距离分株对光强和CO_2浓度的响应特征

研究克隆植物不同分株对光强和CO2浓度的响应特征,以红颜草莓为研究对象,采用Li-6400便携式光合作用测定系统,原位测量叶片的净光合速率(Pn)对光合有效辐射(PAR)与胞间CO2浓度(Ci)的响应曲线。结果表明,草莓的光响应和CO2响应曲线均可用直角双曲线修正模型方程来拟合。光饱和或CO2饱和时草莓远端分株的最大净光合速率(Pmax)和表观量子效率(AQY)显著高于近端分株,但光饱和点却显著低于近端分株。光补偿点(LCP)、暗呼吸速率(Rd)、CO2饱和点(CSP)、CO2补偿点(CCP)、光呼吸速率(Rp)和Ru BP羧化效率(CE)在草莓的基株和分株间差异显著。远端分株保持较高的净光合速率有助于草莓累积更多的同化产物,占据更多空间以获得更多的资源,使得种群规模迅速扩大。     

干旱胁迫下腐植酸肥料对燕麦光响应曲线的影响

为探究燕麦光合作用对干旱胁迫下喷施腐植酸的响应机制,采用盆栽方式在正常供水(75%田间持水量)、中度干旱胁迫(60%田间持水量)和重度干旱胁迫(45%田间持水量)3个水分条件下喷施腐植酸(HA)和等量清水(CK)处理,用(CIRAS-3)光合测定系统测定并拟合燕麦叶片的光响应过程。结果表明:1)在直角双曲线模型、非直角双曲线模型、指数模型和直角双曲线修正模型中,只有直角双曲线修正模型拟合得到的各项特征参数比较精确。2)喷施HA可以有效缓解重度干旱胁迫造成的光抑制现象。3)重度干旱胁迫下喷施HA相比于CK,燕麦叶片的最大净光合速率(P_nmax)、暗呼吸速率(R_d)和表观量子效率(Φ)显著提升,光饱和点(LSP)与光补偿点(LCP)降低。随着光合有效辐射(PAR)的增加,叶片蒸腾速率(T_r)和气孔导度(G_s)的提升速率加快,胞间CO₂浓度(C_i)的下降速率减缓。4)喷施HA显著增加重度干旱胁迫下的燕麦产量,籽粒产量和生物产量均与光饱和点(LSP)和光补偿点(LCP)呈极显著负相关,与最大净光合速率(P_nmax)和暗呼吸速率(R_d)呈极显著正相关。综上所述,重度干旱胁迫下,燕麦叶片光合机构受到损伤,喷施HA缓解燕麦叶片光合机构受害程度。     

模拟酸雨胁迫下Ca2+对葱兰(Zephyranthes candida)的调控作用

探讨不同pH模拟酸雨对葱兰主要生理特性的影响及Ca²⁺的调控作用。通过盆栽试验,研究10 mmol/L Ca(NO₃)₂处理后不同pH(2.0、2.5、3.0、4.0和5.6)模拟酸雨胁迫对葱兰的有机物代谢、膜系统稳定性、抗氧化酶活性、叶绿素(Chl)及气体交换参数的影响。结果表明:随着pH的降低,葱兰叶片相对电导率(γ)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)逐渐升高,可溶性蛋白、可溶性糖含量和过氧化物酶(POD)逐渐下降;Chl和净光合速率(Pn)随pH的降低而降低,气孔导度(Gs)和胞间CO₂浓度(c_i)先随pH的降低而升高,当pH 2.0时显著降低;在pH≤4.0时,可溶性糖与pH呈显著正相关,SOD和Pn均与pH呈显著负相关。同一强度酸雨胁迫下,经10 mmol/L Ca(NO₃)₂处理后,葱兰叶片中可溶性蛋白、可溶性糖、POD、SOD、Chl和Pn均有不同程度的升高,γ和MDA显著降低,且各指标的变化随pH的降低变化不明显。模拟酸雨胁迫下,Ca²⁺能增强葱兰各项生理功能的稳定性,从而减轻酸雨对葱兰的伤害,试验还发现,Ca²⁺对葱兰的调控作用在强酸度(pH≤3.0)胁迫下,效果更明显。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

家蚕glial cell missing (BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

【目的】鉴定、克隆家蚕（Bombyx mori）glial cell missing (BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx 和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法检测BmGcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建BmGcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】BmGcm（BGIBMGA006182）定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长 4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其cDNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 kD,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中BmGcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示BmGcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,BmGcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将BmGcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达BmGcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达BmGcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现BmGcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。     

番茄SYTA的克隆及表达分析

【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾鮰的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。     

玉米大斑病菌MAPK基因St IME2的基因组定位、蛋白质结构预测及表达分析

【目的】确定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)MAPK基因St IME2在基因组中的位置;系统解析目的蛋白质St Ime2的结构特征;分析玉米大斑病菌St IME2在不同发育时期及不同胁迫条件下(温度、氧胁迫、高渗胁迫)的表达,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过本地Blast搜索玉米大斑病菌基因组数据库,确定St IME2在基因组的精确位置;利用Prot Param在线分析St Ime2蛋白的理化性质,利用SOMPA在线软件预测St Ime2蛋白的二级结构。通过PHYRE2在线服务器对St Ime2蛋白的三维结构进行预测。利用半定量RT-PCR方法分析不同发育时期及不同胁迫条件下St IME2的表达。【结果】玉米大斑病菌St IME2为一类与酿酒酵母中Sc IME2具有较高同源性的基因,为在植物病原真菌中鲜有报道的MAPK基因。该基因的ID为98 105,位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置,St Ime2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;该基因在病菌分生孢子时期表达量最高,附着胞发育时期表达量最低。将病菌置于不同温度条件下处理,发现培养温度为28℃时St IME2表达量达到最高。在高渗胁迫条件下,随Na Cl浓度的增加,St IME2的表达量逐渐增加,但在较高胁迫条件下(0.8 mol·L-1 Na Cl),该基因表达几乎被完全抑制。经H2O2胁迫处理后,St IME2的表达量随H2O2的浓度增加而增强,在10 mmol·L-1 H2O2的处理下表达量最高。【结论】玉米大斑病菌St IME2位于scaffold_7正链的1 560 184—1 562 574位置。St Ime2蛋白具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,为一类功能鲜有报道的MAPK蛋白激酶。该基因在玉米大斑病菌分生孢子时期表达量最高,推测可能在调控病菌分生孢子发育过程中起重要作用。该基因的表达水平可随培养温度的变化而变化,28℃表达量最高。该基因可能参与病菌的高渗胁迫及氧胁迫反应。     

氮磷钾肥料对苦豆子产量和苦参碱含量的影响

本研究采用“3414”不完全正交回归设计方案,分析了氮、磷、钾肥不同水平对苦豆子产量及苦参碱含量的影响.结果表明:1)N+P+K、N+P、N+K三种施肥组合与苦豆子产量相关性最大,单施N、P、K和P+K对其影响较小.2)复合施肥N、P2O5、K2O用量分别为134.85、91.0、59.9 kg/hm2时苦豆子产量最高,约为2 016.75kg/hm2.3)综合考虑各药用部位苦参碱含量,施肥量的最优范围为N 125～180 kg/hm2、P2O5 80～90 kg/hm2、K2O10～45 kg/hm2.     

家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L~(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L~(-1)。在20 mmol·L~(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L~(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L~(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。     

植物病原菌拮抗性野生艾蒿内生菌的分离、筛选和鉴定

从野生艾蒿的根茎叶部位分离出内生细菌共68株,以棉花枯萎病、稻瘟病、烟草赤星为供试病原菌,采用对峙法对内生菌分别进行抑菌试验,对筛选出的菌株进行了16S rDNA序列测定和系统发育分析.结果表明:从野生艾蒿分离到的内生菌经初筛、复筛,获得抑制病原菌效果最明显的3株菌,结合生理生化特性、菌落特征、细胞形态特征和16S rDNA测序分析结果,菌株L8、Sll和R6分别鉴定为Bacillus subtilis,Bacillus cereus,Paenibacillus polymyxa.拮抗实验表明,棉花枯萎病原菌菌丝发生弯曲、打结,烟草赤星的受作用菌丝生长端分枝明显增多,生长端边缘呈珊瑚状分枝,并且出现明显的畸形和萎缩现象.分析表明,可能是由于在培养过程中内生菌产生了化感物质,对病原菌的菌丝产生抑制作用的结果.