羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡及免疫细胞因子的影响

旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响.在ORFV118基因克隆基础上,成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞,Western Blot...     

刚毛柽柳ThγGCS基因克隆及表达分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是植物细胞内谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶,在植物许多的生理过程中具有重要作用。从刚毛柽柳转录组数据库中分析并获得1条刚毛柽柳γGCS基因全长c DNA序列,命名为ThγGCS。该基因全长2 121 bp,开放阅读框为1 536 bp,编码511个氨基酸。生物信息学分析结果表明,ThγGCS推导的氨基酸序列分别与苜蓿、大豆以及橡胶树等具有很高的同源性;进化分析结果表明ThγGCS属双子叶植物γGCS亚类,同橡胶树,芥菜等γGCS分为一组,与单子叶植物的亲缘关系较远。该蛋白质无跨膜结构域,但具有1个保守的GCS2结构域,并被定位于叶绿体中,说明ThγGCS蛋白质较稳定,并属于谷氨酰半胱氨酸连接酶家族。为了研究该基因在不同非生物胁迫下的应答情况,利用实时定量RT-PCR技术,分析ThγGCS在NaCl和PEG胁迫处理后不同时间、不同组织中基因的表达。结果表明,ThγGCS受NaCl、PEG诱导上调表达,推测其可能在刚毛柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。     

肺气虚证小鼠模型造模方法及其对小鼠免疫功能的影响

为筛选肺气虚证小鼠模型最佳造模方法并验证其免疫功能变化，分别选用SO2法、SO2＋寒冷因素刺激法、香烟烟熏法和香烟烟熏＋寒冷因素刺激法重建肺气虚证小鼠模型，检测其体重、肺脏剖检及病理组织变化等指标，筛选最佳造模方法，并测定其腹腔巨噬细胞活性、体外B细胞抗体分泌能力、血清NO含量、淋巴细胞增殖能力及细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量、肺匀浆中sIgA、sIgM水平。结果显示，香烟烟熏＋寒冷因素刺激法小鼠造模完成后出现严重的肺出血、肺组织坏死及炎性细胞浸润等病变，且与对照组小鼠相比，其体重、脾脏指数、胸腺指数分别显著下降18．35％，37．12％，19．69％，肺脏指数显著升高12．73％；小鼠腹腔巨噬细胞活性（P＜0．01）、血清NO水平下降（P＜0．05）；T、B淋巴细胞增殖能力显著升高；细胞因子IL-2（P＜0．01）、IFN-γ、IL-4含量升高（P＜0．05），IL-6含量下降（P＜0．05）；sIgA、sIgM水平均极显著升高。表明，香烟烟熏＋寒冷因素刺激法是肺气虚小鼠模型最佳造模方法，且其免疫功能受损。     

O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

为了构建O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A.重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A 和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达.RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A 和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达.结果证明,本研究成功构建了重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A并在体外进行了表达,这为研制抗FMDV DNA疫苗和IFN-γ的佐剂作用奠定了坚实基础.     

地方品种固始鸭γ-干扰素基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭γ-干扰素cDNA基因序列,自行设计、合成1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸭γ-干扰素基因(DuIFN-γ),并进行克隆和测序。测序结果表明,获得了DuIFN-γ全序列,其大小为515 bp,包含一个完整阅读框,编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列比较分析发现,克隆的固始鸭IFN-γ基因序列与GenBank中4条鸭IFN-γ基因序列中的3条序列(AF087134,AF100929,AJ012254)完全一致,而与另一条北京鸭核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为98.8%。固始鸭与人和其他种动物的IFN-γ基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-γ基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。DuIFN-γ基因的成功克隆为进一步研究固始鸭IFN-γ基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定

用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。     

猪圆环病毒2型和伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪外周血单个核细胞调节性细胞因子mRNA表达的影响

为分析猪圆环病毒2型（PCV2）对伪狂犬病弱毒苗（PRV）免疫反应的影响,用real-time PCR技术检测了仔猪外周血单个核细胞（PBMC）体外单接种和共接种PCV2与PRV后调节性细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达水平。结果表明,PRV能引起IL-4、IL-12p40与IFN-γ的mRNA表达上调,PCV2能引起IL-4、IL-10与IL-12p40的mRNA表达上调;而且,PCV2能抑制PRV诱导IL-4、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达上调,其中对IFN-γ mRNA表达的抑制效果最为显著（P<0.05）,提示PCV2可能会对PRV的细胞免疫反应产生不利影响。     

蟾酥注射液对小鼠免疫细胞影响的实验研究

为了观察蟾酥注射液对小鼠的免疫细胞增殖及其分泌细胞因子的作用,采用中药免疫药理学方法,选择不同浓度的蟾酥注射液作为试验组,分别与小鼠的脾淋巴细胞以及LPS或者ConA共同孵育48 h,检测细胞增殖水平的变化;将蟾酥注射液与小鼠腹腔巨噬细胞共培养,检测蟾酥注射液对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响;将蟾酥注射液与自然杀伤细胞共培养,检测蟾酥注射液对NK细胞杀伤能力的影响;取脾细胞与蟾酥注射液共培养上清,ELSIA法检测蟾酥注射液对几种重要的细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）分泌水平的变化。结果显示蟾酥注射液在一定剂量范围内单独或者协同非特异性丝裂原（Con A或LPS）作用能够显著增强小鼠脾淋巴细胞的增殖能力（P〈0.05或P〈0.01）;蟾酥注射液单独作用可以显著提高巨噬细胞吞噬中性红的能力;蟾酥注射液能够显著提高小鼠NK细胞对靶细胞的杀伤活性;同时蟾酥注射液能够显著增强小鼠脾淋巴细胞分泌Th1型细胞因子。说明蟾酥注射液在体外能够显著提高几种主要免疫细胞的增殖和功能,研究结果显示蟾酥注射具有显著的非特异性免疫增强作用。     

猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：【研究目的】建立猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性引物,经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测,构建LFA-1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×109~1×102拷贝/μL不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA-1：RSq =0.992;CTLA-4：RSq =0.994）;样品检测显示LFA-1与CTLA-4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点,以及其引物在样品检测中的可应用性,为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA-1和CTLA-4表达的变化以及评估猪体免疫功能,提供必要的技术平台。     

蜡样芽孢杆菌PAS38对肉仔鸡生长性能及免疫功能的影响

为了研究蜡样芽孢杆菌PAS38制剂对肉鸡生长性能和免疫功能的影响,选用80只7日龄爱拔益加(AA)肉鸡,随机分成2组,每组4个重复,每个重复10羽,对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加0. 05%的蜡样芽孢杆菌PAS38制剂,试验期35 d。结果显示:试验组鸡体质量及净增质量均比对照组高,但仅在28 d时差异显著(P 0. 05),空肠和回肠淀粉酶和蛋白酶活性均显著或极显著高于对照组(P 0. 05或P 0. 01);试验组的胸腺和脾脏指数在28,42 d时显著或极显著高于对照组(P 0. 05或P 0. 01),法氏囊指数在42 d时显著高于对照组(P 0. 05);试验组血清免疫球蛋白含量均高于显著或极显著高于对照组(P 0. 05或P 0. 01),42 d时试验组血清中IL-2和IFN-γ含量高于对照组(P 0. 05),IL-4含量低于对照组(P 0. 05);试验组肉鸡的胸腺和法氏囊组织中IL-2、IFN-γ、GBP1、IRF1的mRNA表达量均有不同程度地高于对照组,IL-10 mRNA转录水平低于对照组; IL-4 mRNA转录水平在胸腺组织中显著高于对照组(P 0. 05),而在法氏囊组织中则显著(P 0. 05)或极显著(P 0. 01)低于对照组。结果表明,蜡样芽孢杆菌PAS38具有促进肉鸡的生长性能和增强肠道消化酶活性,促进免疫器官的发育,并且通过调节免疫相关基因mRNA的表达来提高机体的非特异性免疫和细胞免疫。     

小麦-中间偃麦草部分双二倍体"中5"的外源染色体的鉴定

应用染色体分带（Ｃ－带）分子原位杂交技术对普通小麦－中间偃麦草（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ２ｎ＝４２）Ｅ１Ｅ１Ｅ２Ｅ２ＸＸ）部分双二倍体“中５”（２ｎ＝５６）的外部染色体进行了鉴定分析,染色体分带结果表明：“中５”的７中间偃麦草当色体不显带或显示出与受体小麦亲本染色体相似的带型,单靠型很难准确地鉴定出这７对外源染色体,分带处理后进行人子原位杂交鉴定出“中５”的７对外源染色体,并发现共     

附红细胞体感染小鼠Th17细胞的表达

为分析附红细胞体感染后Th17细胞所发挥的免疫功能。采用RT-PCR及荧光抗体双标的方法检测小鼠脾脏IL-17的表达变化,结果显示,小鼠感染附红细胞体后,IL-17表达水平显著增高,提示Th17细胞在附红细胞体感染后发挥了重要的免疫作用,为该病的临床诊断、治疗及预防提供了理论依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)囊膜糖蛋白GP5编码基因ORF5不同编码区的原核表达能力,利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5′端N片段和缺失跨膜区的3′端C片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行原核表达,结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物,而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33,25,29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRS阳性血清发生阳性反应,C片段反应性稍弱,而N片段未出现阳性反应,证实ORF5基因编码产物的C端在与抗体结合的反应原性方面具有重要作用。     

猪细环病毒k2型福建株ORF2基因克隆

为丰富福建省猪细环病毒的分子流行病学数据,本研究根据猪细环病毒1a型、1b型和k2型特异性检测引物对临床顽固性腹泻仔猪病料组织进行PCR检测,结果从1例病料中检测到猪细环病毒k2型阳性。并通过设计猪细环病毒k2型ORF2基因特异性引物对阳性病料扩增后进行克隆测序,获得猪细环病毒k2型ORF2基因完整编码区序列。分析发现所克隆的猪细环病毒k2型福建株ORF2基因全长为203 bp,编码有67个氨基酸。本实验株ORF2基因和猪细环病毒k2型代表株德国家猪分离株2p株(Gen Bank登录号AY823991)核苷酸同源性高达97.5%;和猪细环病毒1a型(Sd_TTV31株)和1b型(1p株)代表株核苷酸同源性均低于50.0%,分别为43.9%和47.3%。从遗传进化关系上看,本实验株ORF2基因和Gen Bank中猪细环病毒k2型处于同一遗传进化分支,而猪细环病毒1a型和猪细环病毒1b型均处于其他遗传分支。本研究首次在福建猪群中检测到猪细环病毒k2型感染。     

Biocompatibility of Acellular Porcine Dermis

In vitro cultured vascular endothelial cells (VEC) and mouse 3T3 fibroblasts (3T3) on the acellular dermal matrix , which were made of porcine skins. We made the cell proliferation test with MTT assay and the histological observation after cells were seeded on the acelluar dermis for 1 week with histological section. The cell growth curves showed VEC and 3T3 grew much rapidly on the acelluar dermis.The histological observation revealed VEC had formed a monolayer, some places even had formed 2 to 3 layer. The results suggest that the acelluar porcine dermal matrix have good biocompatibility , it will be widely applied.     

H7N7亚型禽流感病毒血凝素B细胞和Th细胞表位预测及初步鉴定

摘　要 　目的 预测H7N7亚型禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)B细胞和Th细胞相关抗原表位,并对所获表位的抗原性进行初步鉴定。方法 根据禽流感流行趋势,从GeneBank下载H7N7禽流感病毒HA氨基酸序列,使用生物信息学方法,对所下载序列进行预测与分析,获得H7N7亚型禽流感病毒血凝素B细胞和Th细胞相关抗原表位。通过H7亚型禽流感病毒阳性血清,初步验证所选表位抗原性。结果 获得了5个H7N7亚型禽流感病毒候选B细胞和Th细胞表位,经过间接ELISA方法分析,其中HA165~178,HA180~193,HA241~255表序列相对保守,与流行的H7N7亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性,同时具有与H7型禽流感病毒阳性血清抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能。结论 所筛选的表位具有成为H7N7亚型禽流感病毒HAB细胞和Th细胞相关抗原表位的可能,为H7N7亚型禽流感表位疫苗的研究奠定基础。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中非甾体抗炎药残留量

研究建立了猪肉中美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸四种非甾体抗炎药残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。样品中残留的药物经乙腈提取,提取液浓缩后用乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解,正己烷液-液分配净化,最后采用电喷雾串联质谱仪在正离子多反应监测扫描（MRM）模式下进行测定,基质外标法定量。四种药物在各自的线性范围内,线性关系良好,相关系数均为0.999。对猪肉中美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸在定量限（LOQ）、2.5 倍定量限（2.5 LOQ）和5 倍定量限（5 LOQ）三个添加浓度水平下的回收率进行测定,其平均回收率在在72.1%和87.3% 之间,相对标准偏差在2.8%和6.7%之间。美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸的定量限(S/N≥10)分别为1.6、1.6、80 和8.0 μg/kg。该方法不使用固相萃取柱,简化了操作步骤,节约了检测成本,灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求,可为猪肉中非甾体抗炎药残留量的测定提供技术支持。     

AFLP分子标记鉴别大白菜品种

本试验采用AFLP技术,研究了90份来自7个不同栽培地区的大白菜品种材料。共筛选了20对引物,不同引物组合检测多态性谱带的能力有很大的差异,多态性谱带的数量从9条到32条不等。其中E—ACA／M—CTG是大白菜品种十分高效的引物组合,共产生7l条清晰的扩增带,其中有32条多态性谱带,多态性谱带的百分率为45．7％。通过该引物组合,能将90个品种全部区分开来。同时应用该引物组合检测2个大白菜杂交品种(北京新2号,京夏王)各10株,其中有1株北京新2号的谱带异常,其余同一品种不同单株的带型完全一致。表明AFLP标记用于研究品种指纹图谱,并鉴别品种是完全可行的。     

簇毛麦和中间偃麦草rRNA基因位点双色荧光原位杂交分析

簇毛麦和中间偃麦草是小麦改良的重要抗源，为了对导入的外源染色体及片段进行有效鉴定，应用分带和双色荧光原位杂交，将25S－5．8S－18S rRNA、5S rDNA基因分别定于簇毛麦染色体1V短臂和5V短臂上。分别在中间偃麦草的3对、4对染色体上观察到25S－5．8S－18S rRNA和5S rRNA基因，其中有2对染色体在其短臂上有两种核糖体RNA基因。     

抗黄矮病小麦种质的分子标记

应用基因组原位杂交技术分析了抗小麦黄矮病种质的遗传组成,研究表明小麦一中间但麦草部分双二倍体无芒中4(2n=56)具有40条小麦染色体、5对中间僵麦草染色体、3对小麦/中间僵麦草易位染色体,其中1对是罗伯逊氏易位染色体。结果表明无芒中4与远中5的遗传组成有明显差异,是两种不同类型的材料。抗黄矮病小麦种质F940418, T10