贵州猪 鸡源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因调查

为调查贵州省动物源性大肠杆菌质粒介导的喹诺酮耐药基因(PMQR)流行情况,从贵州省5个地区147个规模养殖场采集猪肛门拭子、鸡泄殖腔拭子2469份,分离得到1 928株大肠杆菌,应用PCR方法和基因测序检测大肠杆菌qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA和aae(6′)Ib-c,基因的携带情况。结果表明,6种PMQR基因的总检测率为60.72%,qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA及aac(6′)Ib-cr的检出率分别为9.54%(184/1928)、12.03%(232/1928)、22.04%(425/1928)、4.36%(84/1928)、3.42%(66/1928)和30.65%(591/1928),且细菌同时携带多个基因的情况严重。     

耐氧氟沙星鸡大肠杆菌gyrA基因QRDR的扩增与测序

取临床分离的13株氧氟沙星（OFL）耐药菌，提取其质粒DNA，经纯化后人为模板，用PCR扩增gyrA基因喹诺酮耐药决定区（QRDR）；PCR阳性质粒的菌株，再扩增其染色体gyrA基因QRDR，直接测定质粒和染色体DNA扩增产物序列并进行分析。只有CE01菌株的质粒DNA和染色体DNA可扩增出长度为668bp的PCR产物片段，两者基因序列相同率为98．17％，相同位点突变相同的碱基有5个，相同位点突变不同的碱基有2个。与基因数据库中的大肠在杆菌gyrA基因相应序列比较，该菌质粒DNA PCR产物同源率为97．80％，有13个位点发生突变，3个氨基酸被替换；染色体DNA PCR产物同源率为97．80％，有13个位点发生突变，3个氨基酸被替换；染色体DNA PCR产物同源率98．00％，有12个位点发生突变，2个氨基酸被替换；都包括了国外资料报道的突变率较高的第83位氨基酸的突变。结果表明，该菌株质粒和染色体上都存在喹诺耐经基因，对OFL的耐药可能是质粒诱导和染色体突变共同作用的结果。     

一株多重耐药大肠杆菌耐喹诺酮gyrA基因突变的研究

临床获得1株鸡致病性大肠杆菌CE01，进行药每、质粒转化、耐药质粒消除试验，结果该菌对11种受试抗菌药物全部呈高度耐药，其中氧氟沙星的MIC≥50μg/ml，且含有喹诺酮抗生质粒，溴化乙淀和黄连素作为消除剂作用48小时可使其喹诺酮抗性质粒消除，耐药水平显著下降。聚合酶链反应（PCR）扩增该菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区（QRDR），质粒DNA和染色体DNA均可扩增出长度为668bp的PCR产物片段。经测序分析，两者基因序列相同率为98.17%，相同位点突变相同的碱基有5个，相同位点突变不同的碱基有2个；与基因数据库Swanberg等报道的大肠杆菌gyrA基因相应序列比较，该菌质粒DNA PCR产物同源率97.8%，有13个位点发生突变，3个氨基酸被替换；染色体DNA PCR产物同源率98%，有12个位点发生突变，2个氨基酸被替换。用放射性同位素α-^32P分别标记CE01菌株染色体DNA和质粒DNA的PCR扩增片段制备探针，对CE01菌株进行检测。质粒DNA和染色体DNA分别与质粒控针和染色体探针杂交出现典型的阳性杂交斑。证实该菌株质粒和染色体上同时存在耐喹诺酮gyrA突变基因，对喹诺酮的耐药性是质粒介导和染色体突变共同作用的结果。     

动物源耐氟喹诺酮类药物致病性大肠杆菌gyrA基因的突变研究

用微量稀释法测定盐酸环丙沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药物对20株耐氟喹诺酮类药物的动物源致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),PCR扩增gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片断长度为496 bp,PCR产物直接测序,用DNAStar软件分析氨基酸序列。结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的MIC范围分别为64～>512μg/mL、16～256μg/mL、16～128μg/mL、64～>512μg/mL和64～>512μg/mL。gyrA基因的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Leu(15/20),其次是Asp87→Asn(13/20),其他的为Asp87→Tyr(6/20),Ser83→Trp(4/20),Ser83→Ala(1/20)和Asp87→Gly(1/20)。说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其gyrA基因QRDR的突变表现为多种形式。     

猪源大肠杆菌质粒和染色体介导的喹诺酮类药的耐药机制

采用微量肉汤稀释法对31株猪源大肠杆菌进行6种喹诺酮类药物的敏感性测定,聚合酶链式反应检测质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因qnr、qepA和aac（6′）-Ib-cr,并分析PMQR基因阳性菌株染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因的喹诺酮耐药决定突变区（QRDRs）突变。结果显示,31株猪源大肠杆菌对兽医临床常用的氟喹诺酮类药物均呈现耐药。在31株猪源肠杆菌中共检测到2株携带qnrB10和4株携带qnrS1基因的大肠杆菌,未检测到qnrA、qepA和aac（6′）-Ib-cr。在PMQR阳性菌株gyrA基因的QRDRs中,低耐药菌株的gyrA基因出现83位S→W突变,高耐药菌株的gyrA基因同时出现83位S→L和87位D→N突变。而在parC基因的QRDRs中,大部分耐药菌株出现80位S→I突变,1株耐药菌株出现45位V→L突变。gyrB和parE基因的QRDRs未检测到突变。结果表明,本地区猪源大肠杆菌对兽医临床常用的氟喹诺酮类药物耐药严重,PMQR的出现和QRDRs的点突变可同时协同贡献对喹诺酮类耐药,而PMQR的出现加速了喹诺酮类耐药基因的快速传播。     

一株喹诺酮耐药大肠杆菌耐药基因检测

黑龙江省齐齐哈尔市周边发生了仔猪腹泻情况,通过检测发现致病菌为致病性大肠杆菌。通过药敏试验发现其对恩诺沙星、左氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药。通过PCR探究其携带的耐药基因,发现其含有喹诺酮耐药基因aac(6’)-Ib-cr。表明该株大肠杆菌为质粒介导的喹诺酮耐药菌株,通过aac(6’)-Ib-cr基因编码的变种氨基糖苷甲基转移酶修饰喹诺酮类药物,从而导致药物抗菌活性下降,菌株产生了药物耐药性。     

猪源携带质粒介导喹诺酮类耐药基因大肠杆菌气源性传播的研究

为了调查养猪场携带质粒介导喹诺酮类耐药基因大肠杆菌的气源性传播情况,本试验分别在5个猪场舍内及舍外上风向和下风向不同距离收集空气样品,并在舍内随机采集粪便样品,分离大肠杆菌。药敏试验检测其对14种抗生素的耐药性。以质粒介导喹诺酮类耐药基因(qnr、aac(6')-Ib-cr、qepA)为指示基因,利用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR)鉴定技术,分别对5个猪场不同样品中大肠杆菌的遗传相似性进行分析,评估其向舍外空气的传播情况。结果显示,5个猪场中的大肠杆菌对庆大霉素、卡那霉素、四环素、链霉素、萘啶酸、复方新诺明等12种常用抗生素耐药率较高,且呈现多重耐药。ERIC-PCR结果显示,46.34% (19/41)的舍内空气分离株与粪便分离株来源相同,其中73.68% (14/19)的分离株携带的耐药基因也相同;68.42% (26/38)的舍外空气分离株与舍内空气或粪便分离株来源相同,其中65.38% (17/26)的菌株携带相同的耐药基因。结果表明,起源于舍内粪便的携带质粒介导喹诺酮类耐药基因的大肠杆菌能形成气溶胶污染舍内空气,并借助舍内外气体交换,传播到舍外不同距离空气中(≥400 m),对养殖场周围的环境卫生及社区居民的健康形成威胁。     

嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析

研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及2株敏感菌株为模板，参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列，设计了1对引物，进行gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增，将扩增产物克隆入pMD18-T载体，转化入大肠埃希氏菌DH5α中，小提质粒，酶切鉴定，测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列。发现耐药菌有5个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,174位点的Ile→Phe,202位点的Asn→Asp,203位点的Leu→Arg，耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致。122位点具有保守的Try。     

牛源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测分析

为研究近年来新疆地区牛源大肠杆菌中质粒介导喹诺酮类药物耐药基因的分布及其对喹诺酮类抗生素的耐药情况,本研究于2016-2018年从新疆石河子、沙湾、奎屯、玛纳斯和伊犁5个地区12个规模化奶牛场分离出116株牛源大肠杆菌,药敏试验检测其耐药性,同时利用PCR扩增PMQR耐药基因。药敏试验结果显示,62.93%的菌株对氨苄西林耐药,耐药率最高。对链霉素、四环素、卡那霉素和恩诺沙星的耐药率依次为56.90%、54.31%、43.10%和42.24%。对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率较低,分别为7.76%和11.21%。分离菌主要携带qnrA、qnrS和aac（6'）-Ⅰb-cr 3种耐药基因;116株大肠杆菌中有31株携带PMQR的耐药基因,检出阳性率为26.72%,其中26株仅携带1种PMQR耐药基因,占所有菌株的22.41%,4株携带2种PMQR耐药基因,占所有菌株的3.45%,1株携带3种PMQR耐药基因,占所有菌株的0.86%。综上所述,新疆地区牛源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物基因主要为qnrA、qnrS和aac（6'）-Ⅰb-cr 3种,且对恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星均产生不同程度的耐药性。     

耐氟喹诺酮类药物鸡源大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变检测

用微量肉汤稀释法对180株鸡源大肠杆菌临床分离株进行了6种氟喹诺酮类药物的耐药性监测，大多数分离株对氟喹诺酮类药物表现出高耐药率（52．9％～93．30%）并呈多重耐药性。提取各菌株染色体DNA，对gyrA基因QRDR进行PCR扩增并测序。氨基序列分析结果显示：168株耐药菌株的第83位的氨基酸均发生了变异，由丝氨酸（S）变为亮氨酸（L）；对4种以上氟喹诺酮类药物有耐药性的107株分离株除第83位氨基酸发变异外，第87位氨基酸也发生了变异，88株由天冬氨酸（D）变为天冬酰氨（N），13株为酪氨酸（Y），5株变为甘氨酸（G），1株变为丙氨酸（A），由此表明鸡源大肠杆菌对氟喹诺类药物的耐药程度与gyrA基因QRDR的变异密切相关，第83位氨基酸变异是大肠杆菌现对氟喹诺酮类药物耐药的关键。     

耐氟喹诺酮类药物禽源大肠埃希菌gyrA基因的检测分析

探讨不同禽源大肠埃希菌中喹诺酮类药物的耐药情况及耐药基因gyrA的分布和突变特征。采用K-B药敏纸片法、gyrA基因的PCR扩增,对9株大肠埃希菌进行喹诺酮类药物试验,并将gyrA基因的PCR产物测序,对测序结果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等软件分析。药敏试验结果表明,C1、C2、C3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感,D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星均表现为耐药和中介;gyrA基因的测序结果表明,除B1菌株有1处核苷酸突变位点和B2菌株有14处核苷酸突变位点;B2菌株gyrA基因的氨基酸突变发生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大肠埃希菌的同源性和进化树分析表明,不同禽源耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因与其他9株菌株相比,同源性在90%左右,进化树不在一个分支上,研究中的B2菌株将为大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药机制的研究提供候选菌株。     

绵羊胴体淋巴结中致病性大肠杆菌的分离与鉴定

用常规细菌分离培养法对西宁市某屠宰场60份绵羊胴体淋巴结进行了致病性大肠杆菌的分离培养与鉴定;在检样中共检出致病性大肠杆菌阳性菌株31份,阳性率为51.67%(31/60),结果表明该批羊胴体污染致病性大肠杆菌比较严重。     

一株血清型O101多重耐药牛致病性大肠杆菌菌株的分离鉴定

试验对病料进行病原检测,并对分离到的病原菌进行分子生物学鉴定、血清学鉴定、药物敏感性试验、小鼠致病性试验研究,依据研究结果进行针对性治疗。试验结果:成功分离到一株牛致病性大肠杆菌,该株菌多重耐药,对小鼠具有高度致病性,其血清型为O101,使用该菌株的敏感药物对后续腹泻犊牛进行了及时治疗,成功控制了该养殖场犊牛腹泻的问题。     

猪PLTP基因的PCR扩增及多态性检测

磷酸脂转运蛋白(PLTP)是脂代谢中重要的转运蛋白之一,在机体脂类代谢中主要介导高密度脂蛋白(HDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间的磷酸脂转移,具有调控动脉粥样硬化(AS)、降低血浆HDL水平等作用.对云南大河猪85个血样进行了DNA的提取及检测,PCR扩增PLTP基因并进行PCR-RFLP分析(HaeⅢ).结果表明,PLTP基因具有丰富的多态性,为今后研究该基因的生物学功能提供了依据.     

鸡源致病性大肠埃希菌菌毛基因研究进展

菌毛是鸡大肠埃希菌的重要致病因子之一。文章对鸡源致病性大肠埃希菌菌毛的特点及分类,各型菌毛亚单位基因结构及其功能与控制,鸡源致病性与其他动物源大肠埃希菌菌毛之间的同源性进行了综述。这对了解菌毛亚单位基因结构与致病力的关系,探讨鸡源大肠埃希菌的致病力与分布有重要意义。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

Experimental model of enterotoxigenic Escherichia coli infection in pigs: potential for an early recognition of colibacillosis by monitoring of behavior.

The hypothesis that altered behavior is a sign for an early recognition of disease was tested. The experiment was conducted to evaluate the behavioral patterns of pigs in a model of postweaning colibacillosis. Twenty-five weaned pigs (from a herd that was previously found to be highly susceptible to F4⁺ Escherichia coli strains) were randomly assigned into 5 groups, kept in isolated pens under the controlled ambiental conditions. One day after weaning, the pigs from three groups were intragastrically inoculated (via orogastric tube) with either F4ac⁺ (1466 or 2407) or F4⁻ (1467) nonenterotoxigenic E. coli (non-ETEC) strains, respectively. The pigs from the fourth group were inoculated with F4ac⁺ ETEC strain M1823 and the remaining 5 pigs that received broth containing 1.2% sodium bicarbonate were kept as noninoculated controls. The pigs were examined daily and the frequency and duration of their behavioral patterns, such as eating, drinking, lying, standing, urinating, defecating, rooting and playing were monitored for 300 h during a period of 10 days. In this model, three conditions were also observed in F4-susceptible pigs: (1) acute fatal diarrheal disease; (2) moderate diarrhea and weight loss and (3) no diarrhea and weight loss. The incidence (both frequency and duration) of defecating was significantly higher (P<0.05) in pigs inoculated with F4ac⁺ ETEC strain M1823 as compared to that of noninoculated (control) pigs. Pigs inoculated with F4ac⁺ non-ETEC strain 1466 had a significantly lower frequency of eating (P<0.05) and frequency/duration of drinking (P<0.05) than did the controls. The 1466-inoculated pigs, had an increased diarrhea score, but frequency/duration of defecating was not significantly different. Pigs inoculated with F4ac⁺ non-ETEC strain 2407 spent more time in lying (P<0.05) than did noninoculated pigs. Conversely, the pigs that received F4⁻ non-ETEC strain 1467 laid shorter (P<0.05) and ate/drank less frequently (P<0.05) than the controls. It was concluded that the changed occurrence of defecating and eating in pigs that were inoculated with either F4ac⁺ ETEC (M1823) or non-ETEC (1466) strain, respectively, was consistent with the pending clinical disease, i.e. postweaning colibacillosis.     

动物源性大肠杆菌耐药性分析

目的:对吉林省长春市伊通地区分离出的113株动物源性大肠杆菌耐药性进行分析,了解猪源和鸡源大肠杆菌耐药程度及其耐药谱。方法:采用K-B纸片扩散法对大肠杆菌耐药性初步定性分析,并从中选出十株耐药谱不同的大肠杆菌测定其抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。结果:113株均表现出不同程度的耐药,耐药谱广,且多表现为多重耐药。结论:动物源性大肠杆菌对抗生素的耐药性以多重耐药为主。113株对喹诺酮类、磺胺类、利福平耐药率达到90%以上,其中鸡源、猪源大肠杆菌耐药情况各不相同,二者均对丁胺卡那霉素、先锋必/舒巴坦较敏感,耐药率低于15%,可知丁胺卡那霉素、先锋必/舒巴坦可作为这些地区防治致病性大肠杆菌的首选药物。本实验结果对临床科学合理用药有重要指导意义。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2,T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株,将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中,成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传,且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性,但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明,clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性,为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。