猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 kDa。 Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白亲和肽的原核表达及其病毒亲和性分析

为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白(M蛋白)亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过BamHⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×10~3,5×10~2,2.5×10~2 TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×10~2 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×10~5 TCID50/mL)与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

反义RNA介导的抗猪传染性胃肠炎病毒感染

构建了重组逆转录病毒表达质粒plxas-N,该质粒能表达互补猪传染性胃肠炎病毒N基因全长的反义RNA序列。用质脂体方法将重组质粒plxas-N转染至PA317细胞中,经抗生素G418（500μg/ml）筛选出稳定的产毒细胞克隆。分别扩大培养细胞克隆,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的重组病毒滴度,并用高滴度重组病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞的总RNA,RT-PCR证明plxas-N整合到IBRS2细胞基因组。通过TGEV分别感染IBRS2和IBRS2抗性细胞产生的病变,结果表明该反义RNA对病毒的复制有抑制作用,其抑制率近50%。     

毕赤酵母表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白及其免疫原性分析

为了获得具有良好免疫活性的基因工程抗原蛋白,利用毕赤酵母真核表达系统,表达猪传染性胃肠炎(河北分离株)的纤突糖蛋白。根据Gen Bank TGEV S基因设计一对引物,经PCR扩增出长2.2 kb的目的基因S,将S基因亚克隆于p PIC9k载体,转化TOP10感受态,PCR、酶切鉴定阳性克隆,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,然后电转GS115感受态,利用G418抗性进行多拷贝整合子初步筛选,提取基因组并做PCR鉴定,得到阳性菌株,经诱导发酵后,上清发酵液经SDS-PAGE电泳检测,显示获得分子量为82 kDa左右的目的蛋白,同时用Western-Blotting检测到一条特异的目的条带;用目的蛋白免疫小鼠,ELISA检测免疫S蛋白小鼠血清抗体效价为1∶100,表达蛋白具有免疫活性。     

转基因玉米让病毒无处藏身

<正>南非的农作物科学家开发出了一种玉米品种,它可以抵抗玉米条纹病毒。他们希望这一进展将有助于改善粮食安全并在非洲改善转基因食品的名声。来自南非开普敦大学和     

猪传染性胃肠炎的防治

猪传染性胃肠炎是由病毒引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。本病潜伏期很短,一般为24～36小时,也有的延至2～3天,表现为呕吐、严重腹泻和脱水,不同年龄的猪均可发病。本病呈地方流行,有明显的季节性,以冬、春季发病最多。今年在我国南方地区的低温天气中,该病在许多猪场流行,造成了很大损失。     

猪流行性腹泻与传染性胃肠炎混合感染的综合防制

猪流行性腹泻（PED）与猪传染性胃肠炎（TGE）都是由冠状病毒引起的急性、高度接触性肠道传染病,以呕吐、严重腹泻和脱水为主要特征。近年来,该类疾病在养猪场流行愈来愈严重,并多混合感染,很难从临床症状上区别开来,因此习惯上将二者合称为“冬季拉稀病”或“雪风灌肠”。     

转基因技术在玉米种质改良中的应用

简述了玉米转基因工程中遗传转化的受体系统、目的基因和转基因技术的研究进展.分析了转基因技术在改良玉米品质、抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐、抗旱、抗寒性、雄性不育、抗真菌和抗病毒病基因等方面取得的成效.     

部分地区传染性胃肠炎病毒株S基因的序列分析

猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastraenteritis, TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病。本研究以不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的S基因为靶序列,序列分析不同地区TGEV病毒株S基因的同源性和进化性关系,序列分析包括遗传距离测定、进化树分析和碱基替换分析等。结果表明：S基因在TGEV不同毒株间高度保守,但S基因存在腺嘌呤碱基（A）向胸腺嘧啶（T）突变的倾向。本研究通过对TGEV S基因核苷酸序列分析可为深入研究TGEV的毒力变化和流行病学提供参考。     

猪传染性胃肠炎预防和治疗的研究进展

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以猪的严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。现已成为一种世界性猪的疾病,随着分子生物学的发展,对TGEV的研究取得了较大的进展,就TGEV的预防和治疗的研究进展做一阐述,旨在为探索对该病的更为有效的预防和治疗方法奠定基础。     

转基因玉米研究进展

植物转基因技术开辟了作物遗传改良的新途径。转基因玉米是植物基因工程领域研究的热点之一。近年来,应用转基因技术已经获得抗虫、抗除草剂和其他有用性状的转基因玉米。在此,就玉米转基因在受体系统、目的基因及转化方法方面的研究成果,尤其是近年来玉米转基因研究方面存在的问题、解决途径以及其他类型玉米的转基因研究进展做了综述。     

抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立

本试验建立了一个以除草剂抗性为选择标记的玉米(Zea mays L.)转基因育种中的早期世代批量快速筛选技术.通过对玉米自交系铁7922、吉8902、丹340、PA91以及转Bar基因PA91玉米PA91TBA523在营养钵中浸灌250mg/L、500mg/L、1 000mg/L、1 500mg/L不同浓度的Basta除草剂的萌发试验,确立了不能正常生长的临界浓度:铁7922在250 mg/L的除草剂中无法生长,吉8902在500 mg/L的除草剂中无法生长;转基因材料PA91TBA523在除草剂达到1 500 mg/L仍与不浸灌除草剂的对照无明显差异.利用此方法对花粉管通道法转化获得的转基因T0植株的种子进行鉴定和筛选,从T0植株种子(T1)获得阳性植株6株,3株获得种子,对获得的种子(T2)再做除草剂筛选,抗性植株PCR检测均表现阳性.对以往的转基因T3做批量规模筛选,可以淘汰大量(70%)非转基因和表达不强的株系或个体,减少了田间种植工作量,提高了育种效率.     

ENR基因在高油和普通玉米自交系中的克隆和表达分析

利用高油玉米自交系By804和普通玉米自交系B73为材料,克隆Enoyl-ACP reductase(ENR)基因,同时比较ENR基因的序列和表达差异。结果表明,ENR基因编码蛋白在高油和普通玉米中氨基酸序列完全一致;在授粉后15,25和35 d的胚中,ENR基因呈下调表达,在同一发育时期,ENR基因在高油玉米By804中较高表达。     

转Cry1Ab基因玉米自交系的产量性状配合力

本研究采用6份转Cry1Ab抗虫基因玉米自交系与5份常规玉米自交系为试验材料,利用NCⅡ设计,共组配30个杂交组合,对其穗行数、行粒数、穗重、穗长、穗粗5个穗部性状和小区产量进行方差分析和配合力估算,以鉴定这6个转Cry1Ab基因玉米自交系的育种利用潜力。结果表明,5个穗部性状和小区产量在30个组合间差异均达到极显著水平,小区产量与行粒数、穗重、穗长和穗粗均呈现极显著性正相关,其中小区产量与穗重的相关系数最高;转基因系6的产量一般配合力效应值最高为11.717,其次为转基因系1,效应值为2.946,其他4个系的效应值都为负值;转基因系6产量一般配合力与转基因系1、2、3、4、5有着极显著差异。在30个组合中,M03×转基因系5的特殊配合力效应值最高为25.808 2,其次为PH6WC×转基因系1,效应值为22.221 4;PH6WC×转基因系1的小区产量最高为635.873 kg/667 m^2,其次为M03×转基因系5,产量为593.625 kg/667 m^2。     

芒果MiCO基因逆境胁迫下表达模式分析及转基因株系的获得

CONSTANS(CO)基因是调控植物开花光周期途径的关键基因,近来有研究发现其与植物的逆境胁迫也有关。目前CO参与植物逆境胁迫的作用尚不清楚。为了探究CO在芒果逆境胁迫中的功能,我们利用实时荧光定量技术对MiCO基因在芒果2℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的表达模式进行分析。结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果MiCO基因的表达,其中盐胁迫处理条件下MiCO基因的表达水平上调,2℃低温和PEG胁迫条件下MiCO基因的表达水平下调。说明该基因参与了芒果逆境胁迫的调控。为了验证MiCO基因在芒果逆境胁迫中的功能,本研究构建了MiCO超量表达载体,将MiCO基因转化到拟南芥中,获得阳性植株,经过三代筛选得到了纯合株系,为进一步验证MiCO基因在逆境胁迫中的作用提供实验材料。