玉米大斑病菌Septin基因家族的鉴定与表达模式分析

【背景】隔膜蛋白Septin广泛存在于除植物以外所有真核生物中,是高度保守的GTP结合蛋白家族,被认为是继微管、微丝和中间纤维之后的第4种细胞骨架蛋白。病原真菌的Septin蛋白参与细胞极性的确定、形态塑造及与致病相关的形态转换。【目的】鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Septin基因家族,并进一步分析其在不同发育时期的表达模式,为明确隔膜蛋白Septin与真菌侵染结构发育之间的关系打下基础。【方法】以玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)中6个Septin蛋白的氨基酸序列为探针,在玉米大斑病菌数据库在线Blastp比对和关键词搜索,获得大斑病菌的候选Septin,对其基因结构、理化性质以及跨膜区结构等方面进行生物信息学分析。收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技术系统分析Septin基因家族在玉米大斑病菌侵染结构形成不同阶段的转录水平。【结果】获得了玉米大斑病菌6个候选Sep...     

血红丛赤壳属交配群Ⅵ全基因组候选效应分子的预测和分析

血红丛赤壳属交配群Ⅵ(Nectria haematococca mating populationⅥ)是茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f. sp.pisi)的有性态,由其引起的豌豆镰孢根腐病是豌豆上最重要的病害之一。对该菌候选效应分子进行预测,并对其特征进行明确。通过全基因组测序获得Nectria haematococca mpⅥLQ1菌株全基因组信息,利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和Target P等生物信息学软件和预测程序对其中9 912条蛋白序列进行候选效应分子预测,再通过对上述蛋白半胱氨酸含量、信号肽长度和冗余性分析,获得229个符合条件的候选效应分子,其中大部分为功能未知的假定蛋白。利用生物信息学方法预测出血红丛赤壳属交配群ⅥLQ1的候选效应分子,为进一步研究血红丛赤壳属交配群Ⅵ的致病机制奠定了基础,并为其他病原菌效应分子的预测与分析提供了参考。     

玉米大斑病菌StSLT2基因结构与表达模式分析

本研究利用生物信息学技术分析玉米大斑病菌StSLT2基因的结构特征,并利用RNA-Seq技术分析了StSLT2基因在不同发育时期的表达模式。研究发现玉米大斑病菌StSLT2基因DNA全长为5 842 bp,cDNA全长为3 105 bp,包含13个外显子和12个内含子,编码1 034个氨基酸;该蛋白包含S_TKc保守结构域,在该区域内包含1个典型的MAPK蛋白激活域(TEY);对该蛋白的系统发育分析表明,玉米大斑病菌与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和白菜黑斑病菌(Alternaria brassicicola)的SLT2基因之间的进化关系最近;对其表达模式分析发现,该基因在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞、侵入钉等5个时期均有不同水平的表达,其中在分生孢子发育时期的表达量最高,在芽管形成时期表达水平最低。以上结果表明,该基因对玉米大斑病菌分生孢子的发育有重要的调控作用。该研究不仅明确了玉米大斑病菌StSLT2的结构及其表达模式,也为揭示其功能奠定了基础。     

玉米大斑病菌Velvet基因家族生物信息学分析

采用生物信息学方法对玉米大斑病菌Velvet基因家族成员进行序列鉴定,并从理化性质、保守结构域、二级及三级结构以及功能域等方面进行预测和分析。结果表明,该家族各成员无信号肽结构。玉米大斑病菌Velvet家族基因与其他植物病原真菌Velvet家族基因具有较高同源性。该家族成员具有典型的Velvet超家族保守结构域。二级结构分析结果显示,该家族各成员蛋白质的结构元件均主要由无规则卷曲构成。家族成员可能通过可逆磷酸化在植物病原真菌的次生代谢中发挥作用。上述结果为进一步研究Velvet基因家族在植物病原真菌次生代谢中的作用打下了基础。     

解淀粉芽孢杆菌抑菌活性初步研究

为了进一步分离纯化抑菌蛋白和脂肽类物质,促进拮抗菌的开发和利用,选取2株对多种植物病原真菌具有良好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌,利用硫酸铵沉淀法粗提2株菌株的抑菌蛋白,酸沉淀法粗提脂态类抑菌物质,分别测定粗提物对多种植物病原真菌的抑制效果。初步检测2株菌株是否具有产纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素活性。结果表明:BQD1菌株20%~30%的蛋白粗提液对玉米大斑病菌拮抗作用最强,抑菌直径达31.48mm。TY菌株30%~40%的蛋白粗提液对玉米大斑病菌抑菌直径最高达34.20mm。2株菌株脂态类粗提液对靶标病原菌株的拮抗作用均高于其发酵液,且均可产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素。     

植物病原真菌产漆酶菌株的筛选

 【目的】从常见植物病原真菌中筛选具有漆酶活性的病原菌,对相对酶活力较高的菌株进行漆酶致病力测定,为深入研究漆酶在植物病原真菌致病过程中所发挥的作用及病菌的扩展机理奠定基础。【方法】以2,2’-连氮-双[3-乙基苯并噻唑-6-磺酸](ABTS)为底物,通过平板显色反应筛选得到产漆酶的病原菌,同时利用苯胺蓝(Azure-B)脱色法确定目标菌株降解木质素作用,采用分光光度计法在420 nm下测定漆酶活性,最后利用组织病理学分析漆酶对病原菌致病力的影响。【结果】从20种重要植物病原真菌中筛选得到10种产漆酶的病原菌,且均具有降解木质素的作用,对其中6种颜色变化不同的病原菌进行漆酶活力测定,发现玉米大斑病菌的胞内漆酶活力最高,为18.984 U?mL-1,小孢拟盘多毛孢的胞外漆酶活力最高,为0.919 U?mL-1。致病力测定表明,在玉米大斑病菌的致病过程中,漆酶可以氧化玉米叶片并能够促进病原菌在寄主组织中的扩散。【结论】在产漆酶的植物病原真菌中,漆酶大多以胞内酶形式存在,并具有降解木质素的作用,漆酶可以促进玉米大斑病菌在寄主组织中扩展。     

禾谷镰刀菌全基因组候选效应因子预测与分析

本研究根据已公布的禾谷镰刀菌的全基因组信息,以其全基因组蛋白序列为试验材料,通过生物信息学方法,对其候选效应分子及其功能进行预测和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor、TargetP等程序依次预测出其分泌类型的蛋白,再通过其序列大小和半胱氨酸的含量作进一步筛选,最后利用Blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对,找出数据库中没有蛋白同源性的序列,从而获得候选效应分子。最终对禾谷镰刀菌全基因组的14 038个蛋白序列进行分析,预测了126个符合条件的候选效应分子。本研究通过LTR-FINDER程序对禾谷镰刀菌全基因组内的转座子进行分析,但未发现转座子存在,值得进一步分析研究。本研究采用生物信息学分析方法预测出了禾谷镰刀菌的候选效应分子并查找其基因组内转座子情况,可为进一步研究这些效应分子的功能,了解禾谷镰刀菌进化奠定基础。     

玉米大斑病菌热激蛋白Hsp70的鉴定和结构分析

【目的】对玉米大斑病菌Hsp70(Setosphaeria turcica Hsp70,StHsp70)基因家族进行结构鉴定和功能分析,为进一步阐明StHsp70在玉米大斑病菌生长发育和致病过程中的作用奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库获得StHsp70基因家族成员,利用生物信息学方法进行理化性质、亚细胞定位、系统进化、保守基序和结构域分析,构建三级结构模型,并预测启动子等顺式作用元件。【结果】StHsp70基因家族包括11个成员,分别为StHsp70-1～StHsp70-11,多数定位于细胞质,其次为内质网、线粒体和细胞核。系统进化分析结果表明,StHsp70家族成员可分为7类,其中Class A～F分别与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）热激蛋白SSA、 SSB、 SSC、KAR2、SSE、SSZ高度同源,而Class G在酵母中未发现其同源蛋白。结构预测分析发现,StHsp70家族成员都含有保守基序Motif 5,而Motif 6只存在于Class A～D中,Class G仅含有2～4种基序,与其他StHsp70家族成员存在显著差异。N端的N...     

中草药提取物对5种植物病原菌的抑菌活性研究

[目的]探讨8种中草药提取物对5种病原菌的抑菌活性。[方法]用95％乙醇提取8种中草药,用生长速率法测定中草药提取物对白菜软腐病菌、水稻恶苗病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、水稻纹枯病菌5种植物病原菌的抑菌活性,研究pH值对丁香提取液抑菌作用的影响,确定丁香提取液的最小抑菌浓度（MIC）。[结果]除细辛对白菜软腐病菌,黄芪对玉米小斑病菌,黄芪、仙鹤草对水稻纹枯病菌外,8种中草药提取物对供试病菌生长具明显的抑菌作用,其中丁香提取物对5种植物病原菌的抑菌作用最强,均为100％。丁香提取物对5种植物病原菌的最低抑菌浓度（MIC）各有不同,适宜pH值的范围较广。[结论]该试验结果为开发中草药作为植物源农药防治植物病害打下基础。     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的活性及其对酵母生长的功能互补分析

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录激活活性;酵母互补试验表明,StSTE12可以回复酿酒酵母ste12Δ的功能,能够调控酵母细胞的生长。【结论】玉米大斑病菌StSTE12属于STE12-like基因;转录因子StSte12具有转录活性;对酵母细胞在YPD培养基上的侵入生长有重要的调控作用。     

全基因组预测哈茨木霉的效应子

【目的】通过采用高通量技术筛选哈茨木霉菌株的效应子。【方法】根据哈茨木霉CBS 226.95菌株全基因组14 065个蛋白序列信息,利用SignalP、TMHMM、TargetP和Protcomp等生物信息学软件和预测程序进行分泌蛋白预测。【结果】分析得到709个蛋白,占总蛋白的5.04%。再对709个分泌蛋白与胞外酶数据库进行比对分析、半胱氨酸含量、multiple tandem repeats分析,筛选获得300个氨基酸的小分子蛋白作为候选效应蛋白。共获得24个蛋白,其中有3个是碳水化合物结合模块家族蛋白,其余21个为假定蛋白。【结论】本研究利用生物信息学方法从哈茨木霉基因组中预测出候选效应子,为进一步研究效应子在拮抗真菌与病原真菌及植物间的互作关系奠定了基础。     

西瓜果斑病菌T2SS分泌蛋白的筛选和功能预测

利用KEGG和STRING数据库分析比较瓜类果斑病菌(西瓜嗜酸菌)(Acidovorax citrulli,Ac)和主要植物病原细菌Ⅱ型分泌系统(T2SS)的基因组成,收集有试验证据的植物病原细菌T2SS分泌蛋白序列信息,与已测序并经注释的果斑病菌AAC00-1菌株基因组进行序列比对,筛选出候选的果斑病菌同源T2SS分泌蛋白。通过对筛选出的分泌蛋白的信号肽、代谢通路、蛋白互作网络及其在植物细胞中的定位进行分析,预测部分分泌蛋白的生物学功能。     

土壤拮抗细菌的分离与抗植物病原真菌活性初步研究

为了分离筛选出土壤中对植物病原真菌具有拮抗作用的细菌,以4种土传病害病原菌为诱导菌株,采用土壤颗粒撒布法,从不同生态区农田土壤样本中分离得到55株拮抗细菌菌株。测定了部分拮抗菌株及发酵滤液对植物病原菌的拮抗作用。结果表明:分离获得的细菌菌株对病原真菌均表现出一定程度的抑制作用,其中对菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌丝抑制率达60%以上的拮抗菌株,分别有1、12和8株。9株拮抗菌发酵滤液对大豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)和马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)6种植物病原菌表现出较高的抑菌效果,其中YS7菌株发酵产物对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、水稻恶苗病菌均表现较强的抑菌活性,对玉米大斑病菌抑菌圈直径最大达到了56.2mm。从抗菌谱上看,27株拮抗菌株代谢产物对4种以上的拮抗对象表现有抑菌活性,表明拮抗菌株代谢产物具有较为广谱的抑菌效果。     

玉米籽粒蛋白含量Meta-QTL及候选基因分析

玉米的蛋白含量与品质直接相关,可通过各种遗传群体对籽粒蛋白进行QTL分析。但是由于使用不同的遗传图谱和分子标记,结果之间无法直接比较分析,数据也无法整合和利用。为了综合、系统分析玉米籽粒蛋白的QTL位点,收集和整理了289个已报道的玉米籽粒蛋白含量QTL相关信息,采用Bio Mercator4.2软件整合不同遗传图谱,通过元分析发掘到44个meta-QTL(MQTL),研究确定了13个在不同遗传群体间具有一致性的QTL位点。利用生物信息学注释一致性QTL位点区段相关候选基因的功能,获得了847个候选基因,功能富集化分析发现13个候选基因显著富集在9个生物学过程中。这些meta-QTL位点及相关候选基因分析可以为玉米籽粒蛋白的分子标记辅助育种、精细定位和基因克隆提供有用的信息。     

具有抗菌活性的水杉内生真菌的分离及筛选

从水杉(Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng)树皮、叶片中分离筛选得到了17株形态各不相同的内生真菌,采用对峙培养法筛选对植物病原真菌,层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)﹑禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)﹑玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)﹑玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)具有拮抗作用的菌株,筛选得到了1株对以上4种病原菌具有广谱抗菌活性的菌株,命名为SS-17。通过对SS-17菌株的形态特征观察及ITS分子鉴定,初步鉴定为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。     

玉米大斑病菌Stgb-1基因正反义表达载体的构建与功能初探

玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是严重威胁玉米生产安全的重要植物病原真菌。本研究在前期克隆得到的玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1的基础上,利用pSO-I质粒成功构建Stgb-1基因正反义表达载体,并将反义表达载体用于转化玉米大斑病菌的原生质体,获得了3个突变体菌株,分别命名为anti-GB-1、anti-GB-2和anti-GB-3。其中,anti-GB-2、anti-GB-3的菌落形态与野生型菌株差异较为明显,anti-GB-1则与野生型菌株没有表型差异。利用anti-GB-1对Stgb-1基因的功能进行分析,发现在反义表达诱导物奎宁酸溶液(15 mmol/L)中,野生型菌株的孢子萌发率为93.7%,而anti-GB-1的孢子萌发率仅为16%。推测Stgb-1基因调控了玉米大斑病菌的分生孢子萌发过程。     

玉米大斑病菌犬尿氨酸途径关键酶基因的鉴定

犬尿氨酸途径（Kynurenine pathway,KP）是色氨酸分解代谢的主要途径，其途径关键酶基因参与多种重要的生物过程。为明确玉米大斑病菌犬尿氨酸途径及其途径关键酶基因在病菌生长发育和致病过程中的功能，本研究利用生物信息学方法，对玉米大斑病菌犬尿氨酸途径中的关键酶基因进行鉴定；利用玉米大斑病菌的表达谱数据，对犬尿氨酸途径关键酶基因在病菌生长发育和侵染过程中的表达水平进行分析。结果发现，玉米大斑病菌中含有犬尿氨酸途径关键酶犬尿氨酸单加氧酶（KMO）、犬尿氨酸酶（KYN）、犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）和吲哚-2, 3-双加氧酶（IDO）的编码基因，犬尿氨酸途径关键酶基因在病菌生长发育和侵染的不同时期呈现高表达水平，表明玉米大斑病菌中存在犬尿氨酸途径，犬尿氨酸途径关键酶基因可能在病菌生长发育和侵染过程中具有重要功能。研究结果为阐明玉米大斑病菌犬尿氨酸途径在生长发育和致病过程中的功能奠定了基础。     

DHN黑色素与玉米大斑病菌附着胞膨压形成的关系

 【目的】探讨玉米大斑病菌胞内DHN黑色素在附着胞膨压产生过程中的作用,明确玉米大斑病菌的侵入机理。【方法】通过诱导玉米大斑病菌附着胞产生,确定附着胞形成的最佳条件,利用溶质排斥技术及incipient-cytorrhysis技术对玉米大斑病菌野生型菌株01-23和黑色素缺失突变体△St3hnr附着胞细胞壁孔径大小和膨压进行测定。【结果】野生型菌株01-23细胞壁孔径范围是2.1—2.7 nm,膨压在5.4 MPa左右;黑色素缺失突变体△St3hnr细胞壁孔径范围是2.7—3.3 nm,膨压在4.1 MPa左右;缺乏黑色素的附着胞不能形成高膨压,丧失了穿透能力。【结论】黑色素层对溶质分子外渗的阻挡作用导致了附着胞高膨压的产生,膨压产生的机械穿透力在玉米大斑病菌穿透基质平面的过程中发挥了重要作用。