坛紫菜种质品系表型性状的变异规律分析

坛紫菜(Pyropia haitanensis)的表型性状是遗传育种的主要考察指标。研究以福建省坛紫菜种质资源库保存的73份种质品系为实验材料,对藻体的5个形态特征和14个数量性状数据进行了统计分析,以探讨坛紫菜表型性状的遗传变异规律。结果表明,坛紫菜藻体的形状、颜色、锯齿大小和扭曲程度4个形态特征与藻体长度、宽度、重量和厚度4个数量性状极显著相关(P0.01),叶片基部形状与藻体长度、宽度、鲜重和厚度显著相关(P0.05);比较不同性状均值发现,线形藻体的平均长度增长速度最快,基部为心脏形的藻体平均重量增长速度最快,无锯齿的藻体厚度最薄。巢式方差分析结果显示,坛紫菜品系间的遗传变异(72.79%)远大于品系内(21.46%),说明品系间的变异是坛紫菜表型变异的主要来源。坛紫菜藻体各表型性状的变异系数为7.14%~35.99%,其中藻体厚度变异系数最低,而单株藻体重量的变异系数最高,说明藻体厚度的选择潜力相对较小,而重量的选择潜力则较大。这些数据为后续坛紫菜的遗传育种提供了基本资料。     

坛紫菜雌雄叶状体的细胞分化比较

以室内培养20～90 d的坛紫菜雌雄叶状体为研究材料,用酶解法分别获取单离细胞进行再生培养。在雌雄叶状体的体细胞再生体中,都出现9种不同发育类型。再生体发育类型的数目和比例与种藻日龄密切相关等结果,证实了离体培养的单离细胞发育成不同形态的再生体是基于其离体前处于不同分化时期所致;由壳孢子分化成性母细胞大致可划分成8个不同阶段。雌雄叶状体的细胞分化途经大致相同,但也有一定差异,雌性叶状体的细胞最终分化成雌性性母细胞,并产生大量的丝状体;而雄性叶状体的细胞最终分化成雄性性母细胞,绝大部分生成精子,但极少数产生丝状体。在雌雄叶状体的细胞再生体中,均产生 “类单孢子”并长成正常叶状体。雄性叶状体成熟较雌性早,与其细胞分化速度较快有关。成熟期不同的雌性品系观察结果表明,叶状体成熟越早、生长期越短,其体细胞分化速度也越快。     

坛紫菜叶状体RNA提取方法的改良与比较

为提取高质量的坛紫菜叶状体总RNA,对常用的几种植物RNA提取方法(CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法)按照去除多糖、多酚的方法进行了改良,并对分离的总RNA根据吸光值、电泳图谱及RT-PCR检测等结果与两种试剂盒(离心柱试剂盒法,RNAiso法)的提取结果进行了比较。结果表明,SDS法、异硫氰酸胍法和RNAiso法3种方法提取的RNA纯度低,质量差,部分RNA已经发生了降解。而改良CTAB法和离心柱试剂盒法提取的总RNA质量可靠,完整性好,纯度高,并且成功去除了可能影响逆转录酶活性的物质,可以进一步应用于cDNA文库构建,基因表达分析等后续实验,但这两种方法各有优缺点,应根据实际情况选用合适方法进行坛紫菜叶状体总RNA的分离。     

坛紫菜（Porphyra haitanensis）营养细胞和原生质体培养的研究Ⅰ

利用紫菜叶状体的营养细胞或原生质体培养成叶状体的研究，国内外已有报道，如卢澄清等(1979)用微生物分解法，赵焕登等(1981)用研磨法、唐延林(1983)用酶解法分离营养细胞，经培养均获得紫菜幼苗，国外仅见M．Polne Fuller et als；(1983)的报告。紫菜属是具有重要经济价值的海藻，进行细胞或原生质体的培养研究，无论从生产上解决苗源的途径或作为选种育种的一种手段来看，     

坛紫菜单个体细胞克隆的丝状体途径

用海螺酶酶解挑选出的具有优良性状的坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶状体制备游离的营养细胞,在显微镜下选取单个细胞放入96孔板中进行隔离培养。一部分细胞通过2种发育途径形成了丝状体:一种途径是单细胞生长一段时间产生突起后发育形成丝状体;另一种途径是单细胞先形成愈伤组织,愈伤组织解体放散出类似"孢子"的细胞,"孢子"再发育形成丝状体。将获得的丝状体扩大培养作为纯系并下海养殖。同普通品系相比,选育的品系在产量和质量上表现出一定的优势。在纯系培育方面,由单倍的叶状体细胞发育形成的二倍丝状体,遗传物质一步纯合,后代叶状体个体遗传性状高度一致,可以保证优良经济性状不丢失。这种紫菜纯系培育方法大幅度缩短了纯系培育周期。     

坛紫菜（Porphyra haitanensis）果孢子在液氮中保存的初步研究

初步研究了坛紫菜(Porphyra haitaneusis)果孢子在液氮(-196℃)保存后的存活率及萌发率。试验表明，甘油和脯氮酸在冷藏中作为低温保护剂是不适用的，二甲基亚砜(DMSO)有效，且以10％浓度为最佳。加入该种浓度DMSO，采用快速降温法，短期冷藏(一小时到五天)，孢子的存活率在25～30％。进行培养试验表明，生存下来的孢子萌发率为50％左右，接近未经冷藏的正常孢子的萌发率，而且幼苗生长健壮。     

坛紫菜杂交重组品系的选育与特性分析

坛紫菜选育品系(HR-6)具有叶状体快速生长期的前期生长较快,色素蛋白含量高,但成熟较早,生长期短,丝状体的壳孢子放散量较少等特性;坛紫菜另一个选育品系(HR-5)具有叶状体快速生长期的前期生长较慢,色素蛋白含量高,但成熟晚,生长期较长,丝状体的壳孢子放散量多等特性。为改善HR-6品系叶状体成熟较早,壳孢子放散量较少的弱点,本文以HR-6品系为父本,HR-5品系为母本进行种内杂交,从杂合丝状体产生的F1叶状体中选育出了综合性状更加优良的品系(WD-7)。在叶状体的快速生长前期(日龄30~45d),父本品系的绝对生长率为6.68cm/d,母本品系为3.63cm/d, WD-7品系为6.67cm/d;在叶状体的快速生长中后期(日龄46~60d),父本品系的绝对生长率降至5.15cm/d,母本品系则升至7.27cm/d,而WD-7品系高达11.54cm/d。父本品系的叶状体成熟最早,培养35d左右,大部分个体已成熟;WD-7品系遗传了母本品系成熟较晚的优点,日龄55d之后,大部分个体才出现成熟。日龄35d的叶状体平均厚度,WD-7品系为29.87μm,分别比父、母本品系增加了10%和16%,藻体的韧性明显增强。WD-7品系的壳孢子放散总量为183.42万个/壳,分别是父、母本品系的1.17倍和0.57倍。上述结果证实,WD-7品系不仅遗传了父本品系叶状体快速生长期的前期生长较快的特性,同时又遗传了母本品系叶状体成熟晚、生长期长、中后期生长快的优点,壳孢子放散量也比父本品系有所增加,此品系有望被培育成适宜大规模栽培的新品种。     

坛紫菜自由丝状体细胞质膜的超微结构观察

本文报道了坛紫菜自由丝状体的细胞质膜在电镜下所作的观察结果。观察表明，丝状体细胞质膜具有三层结构；在丝状体膨大细胞的质膜上观察到内陷现象；相邻的两个膨大细胞间壁上除了有相通的小孔之外，还有细胞壁的特化物孔状联系；在质膜的内陷中除了有从相邻的膨大细胞经间壁小孔透入的液态物质外，还观察到颗粒物质的存在。根据所观察到的质膜结构和内陷现象，本文还就质膜的功能进行了初步讨论。     

坛紫菜自由丝状体响应琼胶寡糖的激发

为了研究琼胶寡糖对坛紫菜自由丝状体藻丝生长和壳孢子囊枝形成的激发的影响,实验采用琼胶寡糖激发坛紫菜自由丝状体,以液相氧电极检测坛紫菜丝状体净光合放氧速率的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜丝状体的H_2O_2释放量;利用LC-MS检测红藻糖苷含量变化;利用实时定量PCR技术检测坛紫菜丝状体H_2O_2产生相关基因(Phrboh、Ph SOD)和红藻糖苷合成相关基因(Phnho1、Phgpdh、Phtps)的表达情况;并利用显微镜观察法检测壳孢子囊枝数量的变化。结果发现,琼胶寡糖能够激发坛紫菜自由丝状体的系列响应,表现在净光合放氧速率以及光合同化产物红藻糖苷的含量和生物合成出现增加;H_2O_2释放量持续增加,与产生H_2O_2相关的2个酶基因Phrboh和Ph SOD的表达增强。此外,琼胶寡糖也能够促进在坛紫菜自由丝状体的发育,在培养第30天时,琼胶寡糖处理组的壳孢子囊枝形成率达到59%,显著高于对照组46%。综上所述,琼胶寡糖能够增加坛紫菜自由丝状体的光合速率和光合同化产物,并通过形成H_2O_2的酶的表达来诱导活性氧的释放;琼胶寡糖还能促进坛紫菜自由丝状体的繁殖发育。     

坛紫菜（Porphyra haitanensis T．J．Chang et B．F．Zheng）菜坛幼苗出现规律的研究

坛紫菜莱坛养殖在我国福建省沿海具有悠久的历史．长期以来。藻农养殖紫菜在附苗之前。利用洒石灰水清除岩石上附着生物的方法进行紫菜生产，已有一套丰富的经验。目前在自然孢子丰富的海区，仍然是一种着有成效的养殖方法，     

坛紫菜北方海区养殖试验

为进一步拓展坛紫菜“南菜北养”的范围,2018年和2019年在山东烟台海区进行了坛紫菜“闽丰2号”的养殖试验。2018年9月中旬将购自江苏、幼苗肉眼可见的网帘投放下海,至12月上旬采收五水(第一次采收的紫菜叫头水或一水紫菜,后面的依次叫二水、三水、四水、五水),总产量为2 359.5 kg/hm²(干质量);2019年8月下旬,采用坛紫菜成熟贝壳丝状体在当地进行采苗、下海,9月下旬进行一水紫菜的收获,至11月中上旬共采收五水,总产量为1 574.3 kg/hm²(干质量)。随着收获期的延长,藻体的长度、宽度均呈增加趋势,但2个年度产量分别以三水和四水为最高。海区营养盐测定结果表明：海水中的无机氮浓度随着养殖时间的延长呈降低趋势,10月份的无机氮浓度明显低于8月份的,晒网同时喷洒施肥后藻体颜色快速好转,且产量有所提高,表明试验海区营养盐条件是影响坛紫菜养殖的重要因素之一。为避免病害发生,在养殖过程中应及时施肥以促进藻体生长,提高坛紫菜的产量和质量。     

坛紫菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达特征

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是植物活性氧(ROS)清除酶促系统的重要成员之一,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料采用RACE技术克隆获得了一条坛紫菜的GPX全长基因序列,命名为PhGPX(Gen Bank收录号:JX673908)。该基因序列全长1027 bp,包含555 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含184个氨基酸,分子量为19.9 k D,等电点为8.76。多序列比对和系统进化树分析结果表明Ph GPX属于植物GPX基因家族成员。基因表达水平的q PCR分析结果表明Ph GPX基因在坛紫菜叶状体和丝状体世代中的表达水平没有显著差异;高温胁迫不同时间水平下,Ph GPX基因的表达水平呈现为先上调后下调的趋势;不同失水胁迫条件下,Ph GPX基因的表达不受低水平的失水胁迫影响,但可被高水平(40%)的失水胁迫所抑制,且在复水30 min后仍然无法恢复失水胁迫前的水平。由此推测坛紫菜体内的GPX也可能存在多种家族成员,不同的逆境胁迫条件、甚至不同的逆境胁迫水平可能需要不同家族成员的GPX参与ROS的清除和防御。     

坛紫菜叶状体对失水胁迫的抗氧化生理响应

失水胁迫是潮间带中高潮区坛紫菜(Pyropia haitanensis)的主要胁迫因子。本研究以坛紫菜叶状体为材料, 探讨其在不同失水程度下细胞中超氧阴离子自由基( ·)含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽还原酶(GR)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和抗坏血酸(ASA)含量的动态变化过程。结果表明, 坛紫菜叶状体生理适应的关键转变点在失水率达到60%时。当失水率低于60%时, 细胞内的活性氧成分以毒性较低的H₂O₂为主, APX活性、ASA含量和GSH含量无显著变化, SOD、CAT和GR活性呈现显著下降趋势; 但当超过60%时, 细胞内的活性氧成分转变为以高毒性的  ·为主, 抗氧化酶SOD、CAT、APX活性无显著上升, 但GR活性、ASA含量和GSH含量均有显著上升。由此间接说明, 坛紫菜细胞在高度失水胁迫时所产生的活性氧成分, 主要是由GR、ASA和GSH作为清除剂去除的。本研究旨在通过探讨细胞抗氧化系统在坛紫菜失水胁迫应答中的作用机制, 为深入了解坛紫菜失水耐受性的生理过程提供理论依据。

     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

短波紫外线辐照坛紫菜壳孢子制备色彩突变体的新途径

壳孢子萌发时期是坛紫菜(Pyropia haitanensis)减数分裂发生的时期,壳孢子萌发形成的最初4个细胞呈线性排列,形成减数分裂四分体,且发生遗传重组的四分体细胞可以决定叶状体的发育模式和性状分离。因此,诱变产生色彩突变的嵌合叶状体相比诱变叶状体产生的点状色块,将更易于获得突变细胞。本研究为获得坛紫菜人工色彩嵌合突变体,使用不同剂量(50、100、200、300、400、500和600 J/m2)的短波紫外线(UV-C,λ=254 nm)辐照坛紫菜壳孢子,培养数天后,在壳孢子苗中出现了色彩突变的嵌合叶状体。结果显示,低剂量(50 J/m2)的辐射促进壳孢子萌发,而辐照剂量高于100 J/m2则会抑制壳孢子萌发和分裂。辐照剂量在50~400 J/m2范围内,色彩突变体出现的频率随辐照剂量的增加而增加,辐照剂量分别为300和400 J/m2时,突变率分别达到15.22%和17.18%。其中,出现色彩突变的嵌合叶状体以2色块嵌合体和3色块嵌合体居多,4色块嵌合体最少,但辐照剂量增加至400 J/m2以上时,随着辐照剂量的增加,色彩突变体出现的频率反而下降,表明最适宜的诱变剂量为300或400 J/m2。同时,短波紫外线辐照也使色彩突变嵌合体的长宽比下降,采用生物酶解法从色彩嵌合体中分离出了单色的体细胞萌发体。本研究为坛紫菜人工色彩突变体的制备和诱变育种提供了新途径。     

坛紫菜丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及表达特征

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。     

3种植物生长调节剂对坛紫菜自由丝状体生长与光合色素含量的影响

采用单因素分析法,比较研究了添加3种外源植物生长调节剂(吲哚乙酸IAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、激动素KT)对野生型坛紫菜(Pyropia haitanensis)自由丝状体生长及光合色素含量的影响。结果表明:与对照组相比,低浓度的IAA(0.5~4.0 mg·L~(-1))和KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))对藻体的特定生长率有显著影响,以2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT对藻体的促生长效应最大,培养25 d时藻体鲜重增加最大,分别是对照组的1.90倍和1.52倍(P0.05)。高浓度的IAA(6.0~10.0 mg·L~(-1))和KT(4.0~10.0 mg·L~(-1))却会抑制藻体生长(P0.05)。培养25 d时,与对照组相比,2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT均有利于叶绿素a(Chl a)和类胡萝卜素(Car)的合成,Chl a含量分别增加了23.7%和23.8%;Car含量分别增加了31.0%和28.6%(P0.05)。然而,高浓度的IAA和KT(6.0、10.0 mg·L~(-1))不利于Chl a的合成,其处理浓度越高,Chl a含量下降越多。与对照组相比,较低浓度的IAA(1.0~2.0 mg·L~(-1))明显促进藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)合成,其中2.0 mg·L~(-1)IAA处理组PE、PC含量最高,分别增加了59.1%和45.7%(P0.05)。较低浓度的KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))均有利于PE、PC合成,其中0.5 mg·L~(-1)KT处理组的PE、PC含量增加最多,分别提高了48.4%和50.5%(P0.05)。高浓度的IAA(6.0、10.0 mg·L~(-1))和KT(10.0 mg·L~(-1))则明显降低了PE、PC合成(P0.05)。2,4-D对藻体的特定生长率和光合色素合成无显著影响(P0.05)。     

不同海域不同品种坛紫菜(Pyropia haitanensis)挥发性成分的比较分析

采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术,结合多变量数据分析,对不同品种、不同养殖海域、不同收割期坛紫菜的挥发性成分进行了分析研究。结果显示,栽培在2个海域的2种品种坛紫菜中,共检测到115种挥发性组分,其中,烃类和醛酮类物质的含量和种类占据了极大优势。主成分分析(PCA)显示,坛紫菜的挥发性组分有明显的品种和地区性差异,不同品种间的主要差异组分有8-十七碳烯、1-十七碳烯、壬醛、2-乙烯基-6-甲基吡嗪、辛醛等成分,不同海域的主要差异组分有8-十七碳烯、壬醛、2-乙烯基-6-甲基吡嗪、1-十七碳烯、苯乙烯等。另外,不同收获期坛紫菜挥发性成分的变化跟养殖海域有密切的关系。     

二氧化碳和阳光紫外辐射对坛紫菜丝状体光合生理特性的影响

为了探索大型海藻生活史丝状体阶段对于海洋酸化与紫外辐射的响应,实验选取经济海藻坛紫菜的自由丝状体作为实验材料。实验设置两个CO2浓度,正常CO2浓度(390 ppmv)和高CO2浓度(1 000 ppmv);3种辐射处理,PAR处理(仅接受可见光)、PA处理(滤除UV-B)、PAB处理(全波长辐射)。研究结果表明,高CO2显著提高了坛紫菜自由丝状体的生长速率,但高CO2处理下坛紫菜自由丝状体中藻红蛋白、藻蓝蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素及紫外吸收物质UVACs分别降低了7.3%、9.3%、19.8%、16.5%和18.7%。高CO2处理的坛紫菜自由丝状体最大光化学效率Fv/Fm,光能利用效率(α)及最大相对电子传递速率(rETRmax)都显著高于正常CO2处理。太阳模拟器下处理的坛紫菜自由丝状体,PAR与PA处理下的抑制率,正常CO2与高CO2处理间无显著差异,然而在PAB处理下,高CO2处理的抑制率要高于正常CO2处理,这可能与其体内紫外吸收物质含量下降有关。PAR处理下的抑制率,无论是在正常CO2还是在高CO2处理下,都显著低于PA及PAB处理,而PA与PAB之间无显著差异。在未来海洋持续酸化的背景下,UV辐射的增加将会影响到坛紫菜自由丝状体的光合生理及生长。