烟粉虱传播的植物病毒病及其化学防治研究进展

烟粉虱是一种世界性重大害虫,传播植物病毒病,严重危害农林业生产。烟粉虱可以传播400多种植物病毒,主要包括双生病毒科Geminiviridae的菜豆金色花叶病毒属Begomovirus、长线病毒科Closteroviridae的毛病毒属Crinivirus、乙型线状病毒科Betaflexiviridae的香石竹潜隐病毒属Carlavirus和马铃薯Y病毒科Potyviridae的甘薯病毒属Ipomovirus。其中,菜豆金色花叶病毒Begomovirus是烟粉虱传播的主要病毒,在所传播的病毒中约占90%。治虫防病是控制此类病毒病的主要方法,双酰胺类及新烟碱类等杀虫剂是目前防治烟粉虱的主要药剂。目前生产中虽然还缺乏对病毒病高效的化学药剂,但抗病毒药剂的研发受到人们的广泛关注。通过对烟粉虱传播的病毒病类型,以及治虫防病的化学药剂进行综述,期望为烟粉虱及其传播的病毒病防控提供思路。     

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。     

番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因dsRNA载体的构建及其表达

将中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)外壳蛋白基因(coat protein CP)同源的部分片段双链RNA重组至植物表达载体pBIN19,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404导入本氏烟(Nicotiana benthamiana).PcR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA中,引起与其同源的基因发生沉默,从而可抑制病毒复制,达到抗该病毒的目的,为防治这类病毒病害提供了新的可能.     

番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因dsRNA载体的构建及其表达

将中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）外壳蛋白基因（coat protein,CP）同源的部分片段双链RNA重组至植物表达载体pBIN19,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404导入本氏烟（Nicotianabenthamiana）。PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA中,引起与其同源的基因发生沉默,从而可抑制病毒复制,达到抗该病毒的目的,为防治这类病毒病害提供了新的可能。     

烟粉虱对几种药剂的敏感度检测及其抗药性相关基因的表达特征分析

为筛选有效防治烟粉虱的药剂,采用琼脂保湿浸叶法,比较了烟粉虱成虫对生产上广泛喷施的5种药剂5%锐劲特、2.5%高效氯氟氰菊酯、4%阿维菌素、70%艾美乐、25%噻嗪酮的敏感性。对比得出烟粉虱对4%阿维菌素的敏感性较好,药剂处理72 h后成虫校正死亡率高达98.01%。70%艾美乐次之,烟粉虱成虫校正死亡率达80.91%。2.5%高效氯氟氰菊酯较差,处理72 h后成虫死亡率40.73%。25%噻嗪酮最差,处理烟粉虱成虫72 h后死亡率低于5.00%。CYP6CM1、Coe1基因分别是烟粉虱对吡虫啉类药剂、有机磷类药剂产生抗药性的重要响应基因,应用Semi-quantitive PCR检测药剂处理72 h烟粉虱成虫CYP6CM1和Coe1基因转录水平表达量变化。发现70%艾美乐处理后,CYP6CM1基因表达量显著升高,Coe1基因表达量与药剂处理前无明显差异。4%阿维菌素处理后,CYP6CM1基因表达量显著下降,Coe1基因表达量与药剂处理前无明显差异。2.5%高效氯氟氰菊酯处理后CYP6CM1基因表达量变化不大,Coe1基因表达量稍有增加。25%噻嗪酮处理后CYP6CM1基因表达量稍有增加,Coe1基因表达量略有下降。不同药剂对烟粉虱的防治效果与烟粉虱解毒酶基因(CYP6CM1、Coe1)的表达响应有一定的关系。     

CYP6CM1基因RNA干扰载体的构建及转基因烟草对烟粉虱抗药性的影响

烟粉虱的抗药性与体内细胞色素P450单加氧酶基因的过量表达有关。根据Q型烟粉虱一个P450基因(CYP6CM1基因)的特异区域构建RNAi载体,通过农杆菌介导法转化烟草,PCR检测获得6个独立转基因株系;以非转基因烟草和T1代转基因烟草饲喂烟粉虱5 d后,荧光定量PCR结果显示取食转基因烟草的烟粉虱体内CYP6CM1基因相对表达量仅为取食非转基因烟草烟粉虱的13%～27%,表明CYP6CM1基因RNAi表达框架可以干扰烟粉虱CYP6CM1基因的表达。     

烟草转GroEL基因抗双生病毒的研究

双生病毒是全球性的重要植物病毒,为提高植物对此病毒的抗性,分离了烟粉虱体内GroEL基因,将其连接到棉花韧皮部特异启动子PGHNBS下游,构建到植物表达载体PBI121上,采用农杆菌介导法转化烟草,获得抗性苗.对抗性植株进行PCR、RT-PCR和病毒侵染检测,结果表明:GroEL基因已经整合到烟草基因组中,并且在转录水平上表达.病毒侵染检测结果显示转基因烟草植株中没有检测到病毒,证明韧皮部特异表达GroEL基因抗双生病毒是可行的.     

Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白1（chemosensory protein 1,CSP1）基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白（以下简称BtCSP1）,研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建pET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达BtCSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni²⁺-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）荧光探针作为报告子,利用荧光竞争结合法研究重组BtCSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol?L^-1 1-NPN滴定BtCSP1蛋白溶液,直至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止,然后再以各供试配基滴定BtCSP1-1-NPN体系,通过配基竞争猝灭1-NPN最大发射波长,并用Scatchard等方程计算表征BtCSP1与配基亲和力大小的解离常数K_D。【结果】克隆了Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,经双酶切和连接构建了pET-30a(+)/CSP1重组质粒,在IPTG终浓度为1 mmol?L^-1的条件下诱导获得了BtCSP1重组蛋白,Ni²⁺-琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度,稀释至1.5 µmol?L^-1作为工作浓度。在荧光光谱试验中,Scatchard方程线性化后（相关系数达到0.9967）,显示BtCSP1与1-NPN的解离常数K_1-NPN为2.78 µmol?L^-1,结合位点数n为0.82,表明两者结合较好,且基本是1:1结合,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中,有多种供试植物挥发物分子能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物,如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯（K_D值分别为26.47、39.43、54.01和83.46 µmol?L^-1）,且3-蒈烯具有较强的竞争结合能力,能在200 µmol?L^-1时将1-NPN报告子相对荧光值竞争至约40%。【结论】Q型烟粉虱CSP1蛋白能与测试的多种寄主植物挥发物产生较为广谱的结合能力,尤其与对烟粉虱有趋避性的挥发物的结合更强,表明CSP1很有可能参与Q型烟粉虱对非寄主植物的趋避行为,这对揭示其入侵寄主选择行为生理机制具有重要意义。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究

以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中.     

陕西地区烟粉虱的寄主种类与危害程度调查

2013 ～ 2014年对陕西省烟粉虱的寄主植物进行了调查、鉴定,并应用危害指数对烟粉虱危害程度进行了评价.调查结果表明:陕西地区烟粉虱寄主植物达28科73种(变种),主要集中在5科植物(葫芦科、十字花科、茄科、豆科和菊科),其中蔬菜上危害达4级的寄主有7种.全省以陕南受害最重,寄主种类较多,陕北受害较轻,并依据寄主植物的分布情况分析了烟粉虱在陕西省的发生现状,预测了发展趋势.     

郑州地区烟粉虱寄主植物种类及发生动态

调查了郑州地区烟粉虱的寄主植物及其在几种主要寄主植物上的发生动态.结果表明,烟粉虱的寄主有14科48种(变种),主要寄主植物是葫芦科、茄科、十字花科、豆科、锦葵科、菊科等;其中,茄科和葫芦科的植物受害最重.7月中下旬至8月上中旬是其全年发生危害的高峰期.     

西安地区烟粉虱寄主植物及其危害程度调查

调查记录了西安地区烟粉虱的寄主植物，经鉴定达24科53种（变种），茄科、葫芦科、豆科、十字花科和菊科的种类较多，其中包括蔬菜、果树、花卉园林植物、经济植物和杂草等，并根据寄主植物上烟粉虱的数量将烟粉虱的危害程度划分成4个不同的等级。     

安徽合肥地区烟粉虱生物型鉴定及其系统发育分析

利用mtDNA COI基因片段对安徽合肥地区烟粉虱生物型进行了鉴定及系统发育分析。结果表明,合肥地区所采集烟粉虱为Q型,且与云南昆明地区的烟粉虱种群同源性达到99.8%～100%,推测安徽合肥地区Q型烟粉虱很可能为外来入侵害虫,其发源地应该与云南昆明地区Q型烟粉虱一致。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

江苏棉田烟粉虱的种群动态及控制

2002～2003年通过系统调查对江苏棉田烟粉虱种群动态规律及其控制技术进行研究。结果表明：扬州市郊区棉田,7月下旬始见烟粉虱成虫,8月中、下旬形成第1个成虫高峰,10月上旬成虫消失;丰县棉田,7月中旬始见烟粉虱成虫,8月中旬出现第1个成虫高峰,10月下旬随着气温的下降田间成虫逐渐消失。棉田烟粉虱虫口密度,江苏北部棉区高于中部棉区,转Bt基因棉田高于常规棉田。黄板对烟粉虱成虫有一定的诱集作用。阿维菌素与吡虫啉混剂、灭多威和氧化乐果对棉田烟粉虱种群有一定的控制作用,其9d的校正虫口减退率分别为82．32％、84．59％和80．03％。     

寄主植物对烟粉虱捕食性天敌——小黑瓢虫发育、存活和繁殖力的影响

分别提供6种寄主植物上的烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]供小黑瓢虫[Delphastus catalinae(Horn)]捕食.结果表明:寄主植物显著影响小黑瓢虫的发育、存活和繁殖.捕食花椰菜上粉虱的小黑瓢虫的发育速度、存活率和繁殖力都占有明显优势,瓢虫种群增长的大小表现为花椰菜(rm=0.0771)胜红蓟(rm=0.0722)豇豆(rm=0.0714)一品红(rm=0.0677)甘薯(rm=0.0640)烟草(rm=0.0540).由此可见,人工大量繁殖小黑瓢虫可采用的寄主植物有花椰菜、胜红蓟、豇豆和一品红,其中花椰菜为首选.     

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。     

山西省中南部温室粉虱的发生与防治

温室白粉虱、烟粉虱是全球温室生产中的重要害虫。由于各地生态环境、栽培植物及管理方式等存在差异,温室粉虱的发生与防治也不相同。温室生产在山西省中南部地区占有重要地位。对山西省中南部6个地区近47个县市温室粉虱的发生与防治调研结果显示:①山西省中南部地区两种粉虱均有发生,100%的地区有温室白粉虱发生,而约有67%的地区有烟粉虱发生,温室白粉虱为山西省温室的主要害虫。②温室粉虱为害的蔬菜中黄瓜受害最严重,即当地受害的主要蔬菜中,94%的地区调查为黄瓜,92%为番茄,72%为茄子。花卉中约67%的调查显示,当地主要受害的是月季,50%为一串红、倒挂金钟等。温室周边其他植物中棉花受害最重,占了所有地区的50%。③化学防治是山西省治理粉虱的主要方法,广泛使用的药剂主要包括噻嗪酮、吡虫啉、拟除虫菊酯类和阿维菌素等。该项调研可为山西省宏观治理温室粉虱提供借鉴。