黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1~3个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏肾脏腮脑肌肉。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1³个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏>肾脏>腮>脑>肌肉。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。     

一个油茶金属硫蛋白基因的克隆与序列分析

在油茶cDNA文库和EST文库构建的基础上,根据油茶金属硫蛋白的FAST序列设计特异引物,以油茶近成熟种子为材料,利用3'RACE技术,克隆到1个金属硫蛋白基因的cDNA全序列.该基因全长为675 bp,其中5'非编码区59 bp,3'非编码区379 bp,开放阅读框长234 bp,编码78个氨基酸;该蛋白含有14个半胱氨酸,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC,CX,CXXC形式排列.预测该蛋白相对分子量为7 864.9 Da;等电点为4.86;37～48位氨基酸间有较强的疏水区.多序列比对发现油茶MT核苷酸序列与茶的相似性达到99%,推导的氨基酸序列与茶完全相同,因此将该基因命名co_mtl.     

二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析

从二色补血草中分离出2个金属硫蛋白基因的cDNA全序列,分别命名为LbMT1和LbMT2。LbMT1全长为569bp,其中5′非编码区23bp,3′非编码区300bp,开放读码框(ORF)长246bp,编码含81个氨基酸的蛋白,相对分子质量为8070,等电点为4.7;LbMT2全长为523bp,其中5′非编码区61bp,3′非编码区216bp,开放读码框长246bp,编码81个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为8000,等电点为5.0。这2个基因编码的氨基酸都含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC、CXC和CXXC形式排列。疏水性分析表明:这2个蛋白都存在35~48个氨基酸之间较强的疏水区。通过对多种植物的MT蛋白序列比对分析表明,金属硫蛋白家族在氨基酸数目上保守性差,但半胱氨酸残基(Cys)的位置和数目保守性达到100%,揭示了Cys对金属硫蛋白的功能十分重要。这2个基因已经在Genbank上注册,LbMT1基因的登录号为EF103574,LbMT2基因的Genbank登录号为EF103575。     

樱桃查尔酮合成酶CpCHS2基因的克隆及序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成的关键基因,本文通过巢氏PCR,从'玛瑙红'樱桃的根系组织中克隆获得一个1176 bp的查尔酮合成酶基因的cDNA序列,编码391个氨基酸,命名为CpCHS2(基因登录号:MT112906).该基因编码的蛋白分子量为42.68 kD,等电点为5.76,属疏水性蛋白且不具有跨膜区,主要定位...     

小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

用TRIZOL法提取了小卷蛾斯氏线虫RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)技术克隆了两条小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因cDNA的3′端序列。将得到的cDNA序列提交到GenBank,分别获取登录号EU049857和EU049858。两个序列长度分别为1372碱基(SCTUB1)和1374碱基(SCTUB2),分别编码434和432个氨基酸,编码的蛋白的分子量在48kDa左右。氨基酸的124~131位存在一个微管蛋白信号片段GGGTGSG。序列分析表明,分离得到的两个基因与其他线虫的微管蛋白基因具有较高的同源性,核苷酸序列同源性在65%以上,氨基酸序列同源性在81%以上,两个氨基酸序列都含有两个氨基酸保守区NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE。     

缺失外壳蛋白羧端155-158序列对TMV侵染性的影响

对野生型TMV—U1的外壳蛋白羧端进行缺失突变,观察到外壳蛋白羧端序列缺失4个氨基酸（即外壳蛋白保留154个氨基酸）的TMV154TAG能较强地系统侵染烟草,并高水平表达外壳蛋白,经过二次转接新烟草植株仍保持较强的系统侵染状况,复制完整病毒粒子。结果说明外壳蛋白羧端序列4个氨基酸序列的缺失对烟草花叶病毒感染和复制无严重影响,对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽技术具有一定的应用价值。     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

犬冠状病毒V1株膜蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中报道的CCVInsavc 1株核蛋白基因(M)序列,用特异性引物对分离的CCVV1野毒株进行了RT PCR扩增,将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T连接得到重组质粒pTM,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该基因全长为789bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。与CCV标准毒株Insavc 1M基因相比,两者核苷酸的同源性为92.1%;推导的氨基酸序列同源性为90.9%,差异主要发生在该蛋白的N端前1/3区域内。在推导的M蛋白氨基酸序列中,发现了3个明显的疏水区,提示该蛋白可能是一个反复跨膜的蛋白;在N端15～17,38～40,234～236位氨基酸存在3个潜在的N 联糖基化位点,可能是形成该蛋白表面抗原决定基的位点。另外,推导蛋白氨基酸序列的疏水性和抗原表位与Insavc 1株M蛋白存在一定差异,提示两者免疫原性可能有差别。     

两个类ADP-葡萄糖转运蛋白基因的克隆和特征

搜索数据库获得了2个新的类似ADP-葡萄糖转运蛋白(BT)基因的序列,通过PCR直接克隆了这2个基因。这2个基因都编码406个氨基酸组成的分子量为43 647Da的蛋白。BT2 A在蛋白氮端有一段59个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽,而BT2 B的叶绿体信号肽长度为58个氨基酸。BT2 A在信号肽后的是一段71个氨基酸长可变区,碳端是276个氨基酸长的功能域;BT2 B可变区由72个氨基酸组成,碳端也是276氨基酸长的功能域。半定量PCR表明,BT2 A为组成型表达,而BT2 B则在胚乳发育的中晚期表达。BT基因进化树分析表明,BT2 A和BT2 B基因是在禾谷类作物分化后由基因倍增产生的。     

高羊茅光敏色素A基因FaPHYA的克隆与分析（英文）

以高羊茅转录组学测序获得的PHYA序列为模板,同时结合3’RACE和5’RACE方法从高羊茅中扩增出PHYA基因的全长c DNA序列,命名为Fa PHYA。该序列c DNA全长3 983 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,293~3 682 bp),编码蛋白为1 129个氨基酸,Fa PHYA的N端由GAF和Phytochrome结构域组成;C端包括2个重复的PAS结构域,1个组氨酸激酶A结构域,1个类似组氨酸激酶的ATP酶结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,Fa PHYA与单子叶植物PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较高,同源一致性水平达85%以上,亲缘关系较近。与双子叶植物的PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较低,亲缘关系相对较远。     

致病性坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了扩增坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列和了解该蛋白的分子特征,以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板,利用染色体步移技术分别扩增已知序列的5'端旁侧序列和3'端旁侧序列,并测序和拼接,对拼接结果进行生物信息学分析。结果显示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,全长4247bp,含有1个3372bp的开放阅读框,编码1123个氨基酸,蛋白质分子质量约为120ku。生物信息学分析表明,该蛋白没有明显的信号肽序列和跨膜结构;该蛋白质第750位~1123位氨基酸残基区域具有较强的抗原性;SMART预测显示,该蛋白存在一个自转运蛋白结构域、血凝活性结构域和多个参与碳水化合物代谢的结构域。上述结果提示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,编码约为120ku的蛋白质,该蛋白质可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族的成员,并且该蛋白质的C端可能具有较强的抗原性。     

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.     

山溪鲵皮肤β-microseminoprotein样蛋白的分离纯化及其cDNA克隆

从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(R)Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白.利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列.该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白.在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性.这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein.初级结构分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白;多重序列比较显示,其氨基酸序列中的10个半胱氨酸位点及15个其他氨基酸位点与高等脊椎动物β-microseminoprotein中同种氨基酸有相同的位点.由此推测该蛋白属于β-microseminoprotein家族.     

枸杞胆碱合成关键酶基因PEAMT的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR和RACE结合的方法,获得了枸杞磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PEAMT基因cDNA全序列(命名为LbPEAMT).LbPEAMT cDNA全长1 863 bp,开放读码框1 497 bp,编码一个由498个氨基酸构成的多肽,理论分子量为56.53 kDa,等电点pⅠ为5.50.通过多种序列比对,该基因编码的氨基酸序列与番茄PEAMT氨基酸的相似性为93％.二级结构预测LbPEAMT蛋白由44.98％的α-螺旋、17.67％的延伸链、6.63％的β-转角和30.72％的不规则卷曲组成.LbPEAMT是一个亲水蛋白.含有2个S-腺苷甲硫氨酸依赖催化活性结构域,分别位于N端65-164 aa和C端290-392aa.每个活性区都包含有4个部分基序,分别为Ⅰ、post Ⅰ、post Ⅱ和post Ⅲ.LbPEAMT的这2个活性区在蛋白、磷脂和小分子甲基转移酶中都是相对保守的.     

山溪鲵皮肤β-microseminoprotein样蛋白的分离纯化及其cDNA克隆

从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(R)Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白.利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列.该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白.在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性.这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein.初级结构分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白;多重序列比较显示,其氨基酸序列中的10个半胱氨酸位点及15个其他氨基酸位点与高等脊椎动物β-microseminoprotein中同种氨基酸有相同的位点.由此推测该蛋白属于β-microseminoprotein家族.     

元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的获得及序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库克隆进行随机测序,获得了元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的cDNA序列。该序列全长为558 bp,5′-端非翻译区为84 bp,3′-端非翻译区为247 bp,开放阅读框长度为225 bp(包括一个终止密码子),可编码74个氨基酸,蛋白分子量为7.51 kD,理论等电点(PI)为6.51,其中含12个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的16.22%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC排列方式,具有植物MT-2的典型特征;经Pfam15.0分析证明,其属于金属硫蛋白家族的成员。BlastP同源性分析,该基因与日本粳稻、大麦的同源性较高,分别为98%和65%。首次得到元江普通野生稻金属硫蛋白基因,为其功能研究提供了基础。     

黄独赤霉素受体基因DbGID1s克隆及生物信息学分析

【目的】克隆黄独赤霉素受体（GID1）基因DbGID1s,并对其进行生物学信息分析,为深入探究DbGID1s蛋白在黄独生长发育中的作用机制提供理论参考。【方法】采用RT-PCR技术克隆DbGID1s基因,利用生物信息学软件对其理化性质、结构域、磷酸化位点及系统发育进化进行预测分析。【结果】克隆获得4个DbGID1s基因序列,命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C,GenBank登录号为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373,长度分别为862、1273、1081和1164 bp,编码292、340、289和360个氨基酸残基。4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17~40301.83 Da,理论等电点（pI）为6.05~8.62,为不稳定的外在膜亲水性蛋白,不存在信号肽序列,其磷酸化位点主要以丝氨酸（Ser,S）为主,且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点,不仅具有α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶水解活性区域,还具有激素脂肪酶（HSL）的保守结构域（HGG和GXSXG）和催化联合位点（S、D和H）。DbGID1s蛋白与其他植物GID1蛋白序列具有较高的氨基酸序列相似性,其中与山药的相似性达90%以上。【结论】DbGID1s基因具有多种植物GID1基因的基本特征,其编码的蛋白具有GID1蛋白典型的结构域,其可能参与赤霉素（GA）信号转导,调节黄独的生长发育。